《食品科学》：江南大学陆健教授等：远安黄茶啤酒抗氧化物质的分离与鉴定

大量文献报道，啤酒具有抗氧化性，且酚类化合物是啤酒中最主要的内源性抗氧化物质，具有较强的自由基清除能力。确定啤酒中酚类物质的含量和组成与内源性抗氧化力之间的关系一直是国内外学者的研究重点。

另一方面，茶叶作为人类最佳的天然保健饮料，在我国历史上有着源远流长的饮用纪录，且备受人们的青睐。茶叶的抗氧化活性是其功能开发方面的重要内容之一，研究表明茶叶中起抗氧化作用的成分主要有茶多酚及其衍生产物、茶多糖、生物碱、维生素以及微量元素锌、锰、铜和硒等。

工业生物技术教育部重点实验室，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江南大学生物工程学院的杨丽霞、吴殿辉、陆 健*等以远安黄茶啤酒为研究对象，基于体外抗氧化活性为导向的策略，以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性（DSA）为评价指标，采用溶剂萃取、树脂吸附、半制备高效液相色谱法对啤酒中的抗氧化物质进行分离制备，结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）鉴定，以明确影响远安黄茶啤酒抗氧化活性的关键单体化合物。本研究结果将有助于深入了解茶啤酒抗氧化物质的来源，并促进茶叶加工，对选择性提高茶啤酒抗氧化活性具有借鉴意义。

1、大孔树脂的筛选

结果如表1所示。X-5型树脂对茶啤酒中抗氧化物质的吸附效果最好，吸附率达84.42%，其次是LX-158、LX-17、D101、AB-8、LX-8型。比较各树脂的解吸率可知，X-5型树脂的解吸率同样高于另外5种树脂。结合吸附率和解吸率的结果可知，X-5型树脂更适用于茶啤酒抗氧化物质的分离纯化，所以选择X-5型树脂用于后续实验。

2、茶啤酒抗氧化物质的初步分离

根据物质的理化性质特征和不同的分离纯化原理，可采用不同形式的方法以达到分离纯化效果，常见的方法有溶剂法、膜分离法、大孔树脂层析法、柱色谱法和高速逆流色谱法等。本实验通过乙醇沉淀、乙酸乙酯萃取和大孔树脂吸附，对茶啤酒的抗氧化物质进行初步分离，具体实验流程见图1。各分离组分的得率和DSA结果见表2。

3、抗氧化物质的半制备液相色谱分离

半制备液相色谱分离是应用较为广泛的分离制备方法，本实验利用半制备液相色谱仪对组分I-1、I-2-2、I-2-3进行一级分离并对各收集组分进行DSA分析，结果如图2所示。

4、物质的鉴定

以组分I-1-12为例对鉴定过程进行说明，利用MassLynx软件分析，其色谱图及总离子流图如图3A、B所示。该组分在负离子模式下具有很强的响应，提取m/z 305离子后的总离子流图呈单峰，且峰形对称（图3C）。对2种碰撞能量（6 eV和20 eV）下该离子的质谱信息（图4）进行比较发现，碰撞能量越高，碎片离子越丰富，因此以20 eV碰撞能量下的质谱信息为判断依据。由图4B可看出，有2个离子峰[M-H]-和[2M-H]-存在，m/z分别为305.060 4和611.138 4。易判定m/z 305.060 4为母离子。此外，该化合物还含有m/z 125.023 3、179.033 9、261.076 8的碎片离子。利用MSFinder进行比对发现，该化合物与EGC的分子质量和质谱信息能够完全匹配（图5）。因此，可确定母离子m/z 305.060 4的化合物是EGC。

其他化合物的分析参照上述步骤，鉴定得到另外7个化合物，结果见表3，图6为各化合物的质谱图。EGCG、EC和ECG同样为黄烷醇类化合物，是茶叶中的主要抗氧化成分。咖啡因、黄嘌呤生物碱化合物，是茶叶的主要呈味物质和生理活性成分，具有祛除疲劳、兴奋神经、强心、促进新陈代谢、利尿解毒等功效以及潜在的抗氧化能力。物质5初步鉴定为1,2,6-三没食子酰-β-D-葡萄糖（1,2,6-TGGP），属于天然水解单宁类物质，是茶叶中的特异成分，在消炎、抑制耐药性病原菌等方面具有明显作用。关于1,2,6-TGGP抗氧化活性的研究鲜见报道，但其结构类似物1,4,6-三-O-没食子酰-β-D-葡萄糖的抗氧化活性已被证实。物质7、8经鉴定分别为Cor和Trp，均在云南凤庆“大山茶”里有过报道。

5、单体化合物的抗氧化活性贡献

鉴于上述得到的8种化合物中，咖啡因为管制品，1,2,6-三没食子酰-β-D-葡萄糖无标样在售，因此对其余6种化合物的抗氧化活性做实践评价。将6种化合物溶于甲醇-水（50∶50，V/V）中配成1 mg/mL的溶液，然后同无茶啤酒和远安黄茶啤酒测定DSA，结果见表4。

为进一步说明EGC、EGCG、EC、ECG和Cor对啤酒抗氧化活性的贡献，对其在啤酒中的含量进行研究，结果如表5所示。

结 论

抗氧化活性对茶啤酒的功能性及风味稳定性具有重要的影响，本研究基于抗氧化活性为导向的策略对远安黄茶啤酒的抗氧化组分进行分离，利用UPLC-Q-TOF-MS共鉴定到8个化合物，其中4个黄烷醇类化合物（1、3、4、6）、1个嘌呤碱类化合物（2）、1个单宁类化合物（5）、1个酚酸类化合物（7）以及1个氨基酸类化合物（8）。对部分化合物进行了单体抗氧化活性和定量研究，结果表明EGC、EGCG、EC、ECG和Cor均具有显著的抗氧化活性，其中，ECG和Cor仅存在于远安黄茶啤酒，且远安黄茶啤酒中EGC、EGCG和EC的含量分别是无茶啤酒中的15.29、722.40 倍和10.48 倍，说明远安黄茶啤酒的抗氧化活性在很大程度上由茶叶的内源性抗氧化物质决定。此外，5种物质对远安黄茶啤酒抗氧化活性的贡献为：EGCG＞EGC＞ECG＞EC＞Cor。EGCG是影响茶啤酒抗氧化活性的最主要物质，这与EGCG是茶叶中最主要的儿茶素，约占儿茶素总量的50%～80%，且具有比VE和VC更强的抗氧化作用的结果一致。

本实验可以为开发远安黄茶深加工产品提供理论依据，为啤酒产业选择性生产具有高抗氧化活性的茶啤酒产品提供指导。然而，这5种物质并不能代表远安黄茶啤酒抗氧化活性的全部，因此，有必要对其他分离组分进行鉴定，以更深入地了解抗氧化物质及其对茶啤酒抗氧化活性的影响。

本文《远安黄茶啤酒抗氧化物质的分离与鉴定》来源于《食品科学》2022年43卷8期262-270页，作者：杨丽霞，吴殿辉，鲁振东，陆健。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210106-062。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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