抑制α-突触核蛋白异常表达改善帕金森病新机制

帕金森病（PD）是第二大常见的年龄相关的神经退行性疾病，其特征是黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元的进行性选择性缺失，同时伴有黑质纹状体多巴胺能终末的缺失和由此产生的运动症状。PD的特征是大脑中形成路易小体（LBs）。LBs主要由磷酸化和聚集型α-Syn组成。因此，降低α-Syn的表达为PD的治疗提供了途径。

2022年5月暨南大学医学院张继春/齐琦研究团队在Molecular Therapy: Nucleic Acid发表文章。DNA/RNA异源双链寡核苷酸（HDOs）是一种新的基因沉默技术，使用特异性靶向α-SYN的α-SYN-HDO，研究人员研究了α-SYN-HDO是否能减轻PD小鼠模型的脑组织病理改变。α-Syn的过表达通过抑制AMP反应元件结合蛋白（CREB）和激活甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）诱导多巴胺能神经元变性，导致脑源性神经营养因子的下调。

α-SYN-HDO对α-SYN的沉默作用强于α-SYN-反义寡核苷酸(ASO)。α-SYN-HDO通过激活CREB和抑制MeCP2，上调脑源性神经营养因子表达，减轻多巴胺能神经元的异常表达。这些结果表明，α-Syn-HDO对α-Syn的抑制通过激活BDNF转录来保护多巴胺能神经元的退行性变。因此，α-syn-HDO有可能成为治疗帕金森病的新药物。

1、α-Syn过表达通过抑制CREB和激活MeCP2下调BDNF表达

BDNF在多巴胺能神经元的存活中起着重要作用，PD患者SNc中BDNF水平降低。首先，研究人员分别通过离体和在体方式：用GFP-α-Syn转染SH-SY5Y细胞，将AAV9-hSyn-human SNCA病毒注射到WT小鼠的SNc中，通过WB证实了α-Syn通过抑制CREB和激活MeCP2下调BDNF的表达。

路易小体痴呆（DLB）的病理特征是脑内α-Syn和磷酸化α-Syn聚集。使用DLB患者的死后大脑样本，研究人员测量了DLB患者和年龄匹配的对照组SNc中p-CREB/CREB、BDNF和MeCP2的蛋白表达。发现α-Syn的过度表达导致CREB的抑制和MeCP2的激活，并导致BDNF的下调。

图一：α-Syn过表达通过抑制CREB和激活MeCP2下调BDNF表达

2、沉默α-Syn表达激活BDNF转录

在本研究中，研究人员设计了一种α-Syn-HDO，还标记了有或没有FAM标签以进行追踪。FAM-α-Syn HDO以时间依赖性的方式被SH-SY5Y细胞吸收。WB显示，α-Syn HDO以剂量依赖性方式降低α-Syn和MeCP2的表达，增加p-CREB/CREB和BDNF的表达。

为了进一步阐明α-Syn-HDO在刺激BDNF转录中的作用，研究人员进行了荧光素酶报告、ChIP-PCR和qPCR，数据显示，α-Syn HDO激活BDNF外显子IV启动子，该启动子被CREB敲除阻断，CREB结合基序的突变完全消除了启动子活性。

此外，α-Syn HDO诱导p-CREB与Bdnf外显子IV启动子之间的相互作用，增强了BDNF mRNA水平。这些数据表明α-Syn-HDO激活CREB，上调BDNF转录。

图二：沉默α-Syn表达激活BDNF转录

3、α-Syn HDO与CREB的激活和MeCP2的抑制相关，导致α-Syn处理的SH-SY5Y细胞中BDNF上调

α-Syn的过度表达导致CREB的抑制和MeCP2的激活，从而导致BDNF的下调。因此，研究人员进一步探讨了α-Syn处理的SH-SY5Y细胞中α-Syn HDO是否与BDNF上调相关。细胞转染实验表明，α-Syn的过度表达显著降低了p-CREB/CREB和BDNF水平的比率，但增加了MeCP2的表达。α-Syn HDO逆转了GFP-α-Syn转染的SH-SY5Y细胞中α-Syn过度表达的影响。

IF显示，α-Syn的过度表达导致了p-CREB和MeCP2在SH-SY5Y细胞核内的重新分布。α-Syn诱导MeCP2核定位和核内更多的点状p-CREB，这种重新分布被α-Syn HDO逆转。这些数据表明，α-Syn HDO可以减弱α-Syn处理的SH-SY5Y细胞中BDNF的下调。

图三：α-Syn HDO与CREB的激活和MeCP2的抑制相关，导致α-Syn处理的SH-SY5Y细胞中BDNF上调

4、α-Syn-HDO减轻α-Syn诱导PD小鼠模型多巴胺能神经元变性

为了检测α-Syn-HDO的潜在治疗效果，研究人员利用注射AAV9-hSyn-human SNCA 病毒构建PD模型小鼠来研究α-Syn-HDO是否通过激活BDNF转录来减轻多巴胺能神经元变性。

行为测试表明，与载体组相比，α-Syn HDO显著延长了PD小鼠在转棒试验中的持续时间。IF显示，PD模型小鼠SNc中的TH免疫反应性下降，但IBA1和GFAP免疫反应性增加，并且这些变化能够被α-Syn-HDO逆转。WB显示，PD小鼠中SNc中的TH表达显著下调，但α-Syn水平增加，而α-Syn HDO能够逆转。

总的来说，这些数据表明α-Syn HDO可以减轻AAV9-hSyn-human SNCA 病毒构建PD模型小鼠中多巴胺能神经元的变性并改善PD样病理表现。

为了进一步验证治疗活性与αSyn-HDO在体内的上述调节之间的联系，研究人员检测了模型小鼠的信号转导。芯片PCR结果显示，p-CREB部分从BDNF外显子IV启动子解离，这被α-Syn HDO逆转。研究结果表明，α-Syn HDO可以通过激活CREB和抑制MeCP2，促进PD模型小鼠的BDNF的表达，从而产生神经保护作用。

图四：α-Syn-HDO减轻α-Syn诱导PD小鼠模型多巴胺能神经元变性

5、α-Syn-HDO减轻MTPT处理的α-SynA53T小鼠多巴胺能神经元变性

MPTP是引起PD病理的最具特征的毒素，注射MPTP可加速SNCA小鼠体内PD病理。因此，研究人员进一步研究了α-Syn HDO对MTPT处理的α-Syn-A53T小鼠的神经保护作用。

行为测试、IF及WB结果均表明，α-Syn-HDO可改善MPTP处理的α-Syn-A53T小鼠的PD样病理。ChIP-PCR结果显示，α-Syn HDO逆转了MPTP处理的α-Syn-A53T小鼠的BDNF表达而产生神经保护作用。

图五：α-Syn-HDO减轻MTPT处理的α-SynA53T小鼠多巴胺能神经元变性

6、α-Syn-HDO在体内外阻断α-Syn病理

为了确定α-Syn-HDO降低α-Syn表达是否改善α-Syn聚集，研究人员评估了α-Syn-HDO对α-Syn-preformed fibrils (PFFs)中α-Syn聚集和磷酸化的影响

将PFFs注射到α-Syn-A53T小鼠体内的SNc中，导致SNc中病理性α-Syn和PD样Lewy病理的细胞间传递。用α-Syn HDO治疗可显著减弱PFF诱导的SNc Lewy病理学，延长小鼠在转棒试验中的持续时间。IF显示，α-Syn HDO显著增加了SNc中的TH免疫反应性，但降低了IBA1和GFAP免疫反应性。WB分析表明，α-Syn HDO处理显著改善小鼠SNc中TH表达的降低以及p-S129和α-Syn表达的增加。

这些结果表明，α-Syn-HDO可以改善α-Syn的磷酸化和聚集，从而减轻PD的病理改变。此外，芯片PCR结果显示，α-Syn-HDO通过促进PFFs处理的α-Syn-A53T小鼠的BDNF表达发挥神经保护作用。

图六：α-Syn-HDO在体内外阻断α-Syn病理

7、总结

综上所述，目前的研究表明，α-Syn的过度表达通过抑制CREB和激活MeCP2，抑制BDNF转录诱导多巴胺能神经元变性，而新型核酸制剂α-Syn HDO可以通过激活BDNF转录来减轻PD小鼠模型中多巴胺能神经元的变性。因此，α-Syn-HDO有望成为PD的一种新的潜在治疗药物。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.05.037

编译作者：brainnews创作团队