《食品科学》：天津科技大学张成林教授等：高效合成L-高丝氨酸大肠杆菌基因工程菌株的构建

L-高丝氨酸属于L-天冬氨酸族非蛋白质氨基酸，是合成必需氨基酸L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-异亮氨酸的前体物。有研究表明L-高丝氨酸还具有提高植物抗逆性、促进家禽生长的功能。由此可见，L-高丝氨酸有望广泛应用于食品、医疗及农业等领域。目前L-高丝氨酸主要通过化学法合成，但由于合成效率低等原因限制了其生产规模和应用范围。近年来，随着代谢工程和合成生物学的迅猛发展，发酵法合成L-高丝氨酸受到广泛关注。

大肠杆菌（Escherichia coli）因遗传背景清晰、生长速度快等特性也被应用于发酵法合成L-高丝氨酸研究。尽管利用E. coli合成L-高丝氨酸取得了显著进展，但构建适用于工业化生产的细胞工厂仍具有挑战性。天津科技大学生物工程学院的张 宇、夏 利、张成林*等人针对上述问题，以E. coli W3110为底盘细胞构建非营养缺陷型的L-高丝氨酸高效合成基因工程菌。首先弱化L-高丝氨酸降解途径削弱其降解；然后通过增强合成代谢流、提高前体物和辅酶供应实现L-高丝氨酸积累；在此基础上促进L-高丝氨酸外排，进一步提高其产量（图1）。

1、弱化苏氨酸操纵子thrABC对L-高丝氨酸合成的影响

在E. coli中，高丝氨酸激酶编码基因thrB与苏氨酸合成酶编码基因thrC及天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶编码基因thrA组成操纵子thrABC，而高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶均参与L-高丝氨酸的降解。为不破坏thrABC操纵子的天然结构并实现thrB和thrC的弱化，拟将该操纵子的启动子替换为不同强度的PBBa_J23108、PBBa_J23109和PBBa_J23114。但启动子替换会引起L-高丝氨酸关键合成基因thrA的弱化，故先在出发菌株E. coli W3110 ΔlacI基因组先整合1 个拷贝强启动子Ptrc调控的thrAC1034T（解除L-苏氨酸反馈抑制）。利用鉴定引物ylbe-U-F/ylbe-thrA-J进行菌落PCR鉴定，thrAC1034T基因整合菌株基因组DNA扩增获得碱基约为1 013 bp的条带（图2），表明thrAC1034T基因整合成功，将菌株命名为H-1。在H-1的在整个发酵过程中，未检测到L-高丝氨酸积累（图3A），其原因可能是L-高丝氨酸被代谢为L-苏氨酸和L-甲硫氨酸等代谢物。

由图4可知，启动子替换成功，将菌株分别命名为H-2、H-3和H-4。为考察PthrABC替换对菌株生长和L-高丝氨酸合成的影响，对其进行摇瓶发酵实验。在不添加L-苏氨酸的培养基中H-2、H-3和H-4能够生长，表明PthrABC替换为弱启动子未造成其L-苏氨酸缺陷（图3B）；H-2无L-高丝氨酸积累，H-3和H-4可分别合成1.5 g/L和0.8 g/L L-高丝氨酸（图3A）。

综上，适度弱化thrBC转录可实现L-高丝氨酸的积累，且不会造成营养缺陷，其效果优于敲除thrB。

2、增强thrA拷贝数对L-高丝氨酸合成的影响

由图5A可知，thrAC1034T基因整合成功，将其命名为H-5。摇瓶发酵实验结果表明，H-5的L-高丝氨酸产量为2.6 g/L，较H-3提高73.3%（图6）。为考察进一步过表达thrAC1034T对高丝氨酸合成的影响，向H-5再整合1 拷贝的thrAC1034T（受强启动子Ptrc调控）。由图5B可知，thrAC1034T基因整合成功，将其命名为H-6。摇瓶发酵实验结果表明，H-6的L-高丝氨酸产量为3.4 g/L，较出发菌株提高30.7%。

3、增加草酰乙酸合成对L-高丝氨酸合成的影响

由图6可知，在H-6的L-高丝氨酸产量提高程度较H-5低，推测L-高丝氨酸前体物供应不足限制了其合成。草酰乙酸是合成包括L-高丝氨酸在内的L-天冬氨酸族氨基酸的重要前体物。

为增加L-高丝氨酸合成代谢流，向H-6基因型整合1 拷贝由自身启动子调控的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc，鉴定结果如图7所示，由出发菌株H-6基因组扩增出碱基数为1 873 bp的条带，由ppc基因整合菌株基因组扩增获得碱基约为3 000 bp的条带，与预期一致（3 249 bp），表明菌株构建成功，将其命名为H-7。H-7的L-高丝氨酸产量达5.8 g/L，比菌株H-8提升了70.5%（图6）。

上述结果表明，草酰乙酸是L-高丝氨酸的限制因素，提高其供应有利于增强L-高丝氨酸的合成。

4、增加NADPH再生对L-高丝氨酸的影响

由图8可知，pntAB基因整合成功，将菌株分别命名为H-8和H-9。摇瓶发酵结果如图9所示，H-8的L-高丝氨酸产量（7.8 g/L）略高于H-9（7.1 g/L），说明pntAB自身启动子效果略优于Ptrc。上述结果表明，增强NADPH再生可有效促进L-高丝氨酸的合成。以往研究均聚焦于L-高丝氨酸代谢途径的改造，鲜见增强还原力供应的相关报道。本研究证明了强化pntAB表达可显著提高L-高丝氨酸的合成。

5、促进L-高丝氨酸输出对其产量的影响

由图7、9可知，H-8和H-9的生物量较H-7显著降低，可能与L-高丝氨酸的毒害作用有关。L-苏氨酸/L-高丝氨酸输出载体具有外排L-高丝氨酸的功能，过表达其编码基因rhtA可有效提高L-高丝氨酸的产量和菌体生物量。为增强L-高丝氨酸输出以提高其产量和菌株抗性，构建了rhtA过表达质粒pTrc99a-rhtA，并将其转化至H-8，获得菌株H-10。如图9所示，H-10的L-高丝氨酸产量达12.5 g/L，比H-8提高了60.2%；其生物量提高12.6%，表明增强L-高丝氨酸输出可有效提高其产量并增强菌株对L-高丝氨酸的抗性。

6、发酵罐发酵实验

如图10所示，菌株于8 h进入对数生长期，32 h后进入稳定期，随后生物量缓慢下降；于4 h可检测到L-高丝氨酸的积累，12 h后合成速率逐渐提升，48 h达到最高，52.1 g/L，其转化率为43%（以占葡萄糖质量计）。由表3可知，本研究所构建的H-10 L-高丝氨酸合成效率高于现有报道且该菌株无营养缺陷，故无需在发酵过程中额外添加营养物质，具有工业化生产的优势。

结 论

采用系统代谢工程策略构建了1 株无营养缺陷的L-高丝氨酸高产菌株H-10，主要策略包括利用弱启动子调控thrB和thrC转录弱化L-高丝氨酸的降解代谢流；过表达关键酶基因thrA fbr 、ppc和pntAB，增强其合成代谢流、前体物草酰乙酸供应及NADPH再生；过表达L-高丝氨酸输出蛋白增强其外排。于5 L发酵罐经发酵48 h，H-10菌株的L-高丝氨酸产量达到52.1 g/L，高于现有报道且发酵过程中无需额外添加营养物质，故具备工业化潜力。本研究采用的代谢途径弱化策略可为工业微生物的代谢工程构建提供借鉴。

本文《高效合成L-高丝氨酸大肠杆菌基因工程菌株的构建》来源于《食品科学》2022年43卷6期81-88页，作者：张宇，夏利，林蓓蓓，张稳杰，徐皓然，张成林。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210220-219。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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