师弟求着问我要的类器官培养手册，看完直呼太香了！

师兄

你最近怎么愁眉不展的？课题评估不顺利？

也不是，就是这个课题需要以肿瘤类器官为模型。我查了一些资料，信息量太大了，不知道该怎么筛选。

师弟

师兄

哈哈哈，原来是这样，你为啥不问我，你师兄可是隐藏的「类器官培养大师」。

这样吗？那太好了，师兄你快点教教我吧。

师弟

师兄

太全了，真是雪中送炭！！！

师弟

肿瘤类器官经过近十年的发展，未来大有可为。其可以模拟肿瘤的病理特征，保留遗传稳定性，是肿瘤病理机制研究的法宝，是药物开发的利器，是个性化诊断和治疗的「替身」。

图 1：肿瘤类器官的应用[21]

Bio-Techne 推出肿瘤类器官的培养流程，与诸位共享。本方案修改自：Driehuis E, et al. Nat Protoc. 2020。

人原代组织准备

注意

涉及到人原代组织的研究必须符合所有相关的机构和政府规定。在收集人原代组织材料之前，必须得到所有受试者的知情同意。

1）收集人原代组织块，按活检部位和/或组织类型（比如正常组织和肿瘤组织）分开放在 50 mL 锥形管中，每管含有 45 mL 冰预冷的 adDMEM/F12+++ 培养基【「+++」表示含有以下三种试剂：adDMEM/F12 培养基 + 100 U/mL penicillin-streptomycin + 10 mM HEPES + 1× (vol/vol) GlutaMAX，在 4°C 保存 ≤ 1 月】。adDMEM/F12+++ 培养基中建议加入 10 μM ROCK 抑制剂（Tocris，Y-27632，货号 1254），以提高细胞存活能力。将组织样本保存在这种培养基中，置于 4°C，直至开始分离。

根据原代组织来源的不同，组织块可在 4°C 下保存至多 72 小时，而不会造成类器官生长的明显损失，但是建议尽快进行下一步。

2）评估获得的组织块是否仅由上皮组成，还是包含脂肪或肌肉组织。如果包含脂肪或肌肉组织，在解剖显微镜下用手术剪刀或手术刀和镊子尽可能去除非上皮成分。

非上皮组织可能会延长消化成单细胞的时间，或导致过高估计具有类器官形成能力的（上皮）细胞数量。

3）在 10 cm 的细胞培养皿中，使用手术剪刀或手术刀将组织切成 1～3 mm3 的小块。

4）根据肿瘤类型适当消化组织。消化液一般以胶原酶为主（肠：II、IV 型；肺：I、II 型；肝：IV 型），浓度为 400～1,000 U/mL，附以分散酶，核酸酶 5～20 U/mL。消化液现用现配，37 ℃ 预热。在消化过程中添加 10 μM ROCK 抑制剂可提高生长效率。如下为结直肠消化液举例可供参考。

表 1. 结直肠消化液配方示例[22]

仔细观察消化情况，对于 2 小时以内的孵育，每 10～15 分钟混合一次，大力晃动，并用 P1000 移液器上下吹打混合物。对于过夜孵育，将混合物置于摇床上。不同类型或者量的组织，消化时间不同，消化时间不宜过长。例如穿刺样本为 10 min，小的组织碎片团为 30 min～1 h。

仔细观察消化情况，因为过度消化会显著降低生长效率。根据经验，在观察到细胞簇（由 2～10 个细胞组成）的混合物时，消化就完成了。在开始培养新的组织类型时，建议在消化过程中取少量样本并铺板，以确定这种特定组织的最佳消化时间。

5）当混合物变得浑浊且剩余的组织碎片被破碎时，使用 P1000 移液器上下吹打 10～20 次，进一步促进组织破碎。从顶部加入 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基，并在 4℃ 下以 200 g 离心 5 分钟，对细胞进行清洗。

6）将沉淀重悬在 10 mL adDMEM/F12+++ 培养基中，并用 70～100 μm 细胞滤网进行过滤。

7）对重悬和过滤后的细胞进行离心，在 4°C 下以 200 g 离心 5 分钟。

如果过筛后的细胞沉淀呈红色，可能有血红细胞污染，建议加入 5 mL 红细胞裂解液 4°C 处理 5 分钟。完成裂解后，在 15 mL 管中加满 PBS 清洗一次，然后在 4°C 下 500 g 离心 3 分钟。

类器官培养

8）吸出上清液，将沉淀重悬在 BME（推荐 R&D Systems® Cultrex RGF，货号 3536-005-02、BME001-10）中。BME 应置于冰上，以防止其凝固，因而操作时应当迅速。BME 的用量取决于沉淀的量。大约 10,000 个细胞应接种在 40 μL BME 中。

切勿过度稀释 BME【BME 应当 > 70%（体积比）】，以确保能形成固化液滴。

9）将类器官和 BME 的混合物滴在预热的 24 孔悬浮细胞培养板的底部，每滴约 10 μL。在每孔中放置 3～4 滴（BME 包被方法请点击了解）。

● 类器官一旦悬浮在 BME 中，应尽快进行铺板，因为 BME 可能在管中或移液器吸头中凝固。

● 培养板应置于 37℃ 的加湿培养箱中，预热过夜。如果未正确预热，BME 液滴会立即平铺在培养板的表面，并且类器官更容易附着在培养板的底部。

10）将培养板置于 37°C、5%（体积比）CO2 加湿培养箱内，孵育 20～30 分钟，使 BME 凝固。

11）准备所需量的类器官培养基（培养基配方请见下表），并添加 10 μM ROCK 抑制剂和原代细胞抗生素 Primocin（100 μg/mL），然后将培养基置于 37°C 水浴中。对于头颈部类器官，在人头颈部类器官培养基中额外添加 0.5 μg/mL 卡泊芬净（caspofungin）。

表 2. 肿瘤类器官的培养基配方示例（终浓度）[1-20]

* 胃癌补充：为了富集胃类器官，单细胞消化时添加 Nutlin-3（3 mM，R&D Systems#3984）但无 Y-27632，培养在无 A83-01、EGF、FGF10，但是有 TGF-beta 1（10 ng/mL），R&D Systems#240-B）的完全培养基中处理 1 周。为了抑制内生 Wnt 的分泌，类器官用 100 nM C59（100 nM，R&D Systems#5148）处理。

* 膀胱癌补充：冻存液为 50% FBS、10% DMSO 和 40% Adv DMEM/F-12。

** 肝癌补充：

1）使用 100 μm 滤网在 300～500 g 下离心 5 分钟。

2）处理的肝癌样本（含胆管癌、肝细胞癌），建议使用 1:1 混合的肝组织经典分离培养基和肝细胞癌分离培养基，因为胆管癌适合在经典培养基中生长。

3）分离和扩增培养基每周换 2 次，都加入 1% penicillin/streptomycin。

4）健康肝 1 周后换成相应的扩增培养基。

5）胆管癌和肝细胞癌 2～3 周后换成扩增培养基，依据肿瘤细胞生长情况来定。

*** 宫颈癌补充：

1）使用 70 μm 滤网 1,200 g 下离心 5 分钟。

2）最初的 2～3 代，建议添加 100 mg/mL Primocin 来防止污染。

该配方根据参考文献整理，仅供参考，建议查询更多文献确定最终配方。

12）一旦 BME 液滴固化（30～60 分钟），翻转培养板并在每孔中小心加入 500 μL 类器官培养基。

切勿直接在 BME 微滴的顶部加入培养基，因为这可能会破坏微滴结构。

13）将培养板置于 37℃、5%（体积比）CO2 加湿培养箱内。

14）每 2～3 天更换一次培养基，从各孔中小心吸出培养基，然后加入新鲜的预热培养基。在前两次传代时，在培养基中添加 ROCK 抑制剂和 Primocin。

● BME 微滴可能会从悬浮培养板上脱落，在培养基中「游动」。在这种情况下，我们建议对类器官进行重新铺板，不要使用 TrypLE 来解离类器官。密切监控类器官的形成。理想情况下是在最初铺板后的 12～14 天内对类器官进行首次传代。

● 切勿过早传代（Splitting）类器官，因为这可能会造成培养终止。

● 在第一次传代时，确保培养物达到最佳密度（根据经验，每 40 μL 培养物中含有 10,000 个细胞）。

肿瘤类器官的传代、冻存及复苏等，

Bio-Techne 将在后续推文中与您分享，

敬请期待！

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关于 Bio-Techne：

Bio-Techne 是生物公司中率先登陆纳斯达克（Nasdaq）的拓荒者之一，2007 年，在上海成立中国分公司，助力中国生命科学事业的发展与腾飞，目前旗下已拥有 R&D Systems®、Novus Biologicals®、Tocris®、ProteinSimple®、PrimeGene® 和 Advanced Cell Diagnostics 等众多一线品牌。

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内容审核：王丹琦
项目审核：陆雯芸

题图来源：图虫创意

参考文献

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[21]. Tumor organoids: From inception to future in cancer research.

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