图文解说细胞传代要点及注意事项

实验原理

传代培养几乎是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长到一定密度都会因为接触抑制而停止生长，之后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需，但培养皿中的细胞很容易受到外界污染，培养液是营养富集的液体，可以支持细胞在其中生长，然而，水能载舟亦能覆舟，“好喝”的营养液，使得细菌们也能在培养液中快乐生长，同时离体培养的细胞也是各类病毒、支原体等的大爱，因此，需要周全保护细胞“宝宝”们，以下所有操作要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。

细胞生长一般经历4个时期：潜伏期、对数生长期、平台期和衰亡期【1】。其中对数生长期指细胞呈指数（2n）增长。处于对数生长期的细胞生长最快，细胞活力最强，是进行实验的最佳时间。

细胞接触抑制是正常细胞生长增殖的关键特性，被认为是调节细胞增殖的关键机制，这种机制可以有效地防止细胞增殖失控。在培养细胞时，正常细胞在高密度情况下发生接触抑制现象，使细胞周期停滞在G0/G1期，从而形成单层细胞【2】。因此我们在细胞发生接触抑制前需要将细胞传代来扩大细胞数量。

材料和器材

材料：培养瓶/皿，离心管，移液管，移液器，废液缸，75%酒精，所需培养细胞。

药品：DMEM培养基，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS缓冲液，青链霉素双抗。

仪器：CO₂培养箱，倒置显微镜，超净台。

实验步骤

细胞传代图解：

【预热含10%血清的DMEM培养基、PBS、0.25%胰酶】

Tips：作为热源的金属珠浴，要留意定期消毒哦~

【从培养箱拿出细胞，镜下观察细胞状态，并判断是否达到了可传代的密度】

【回到超净台中，吸去培养基，加入PBS，晃一晃，润洗一遍】

可重复以上动作，用PBS再次清洗，防止残留培养液中的血清影响胰酶效果。

【吸去PBS，加入0.25%胰酶】

【放入37℃培养箱，开始消化并计时】

【1-2min后，用含10%血清的DMEM培养基终止，通过吹打使细胞脱离培养皿底部，最后将细胞悬液转移至离心管】

【500 rpm细胞离心3min】

【弃上清，加DMEM培养基重悬】

【将细胞悬液加入培养皿中】

具体操作及tips：

无菌操作规范：在实验开始前，需要将超净台紫外照射灭菌（至少20min），我们需要穿好灭菌服，戴好灭菌手套和口罩。

准备工作：将PBS，胰酶，含10%血清的DMEM培养基置于37℃下预热。灭菌离心管，枪头提前放入超净台照射紫外。

所有物品从外面移入超净台都需要喷洒75%酒精消毒，并且同样用75%酒精消毒双手。

① 从培养箱取出细胞培养皿（一般选择处于对数期的细胞），倒置显微镜下观察细胞形态和细胞密度，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

② 用酒精喷壶在培养皿表面喷洒75%酒精消毒，转移培养皿到超净台，打开盖子（注意酒精不要喷太多，打开盖子也要小心，不要让酒精误进入皿内），轻轻吸出旧的培养液，加入适量PBS润洗细胞1-2次（注意从侧壁加入，以免冲掉细胞），弃去PBS缓冲液。

Tips：这一步的目的是要去除培养基中血清对胰酶消化细胞的影响哟~

③ 用移液器加入0.25%胰酶（Trypsin）于培养皿中（能够铺满皿底即可，具体量根据实验需要确定，过多或过少都不利实验），置于37℃培养箱中消化1-2分钟。

④ 将加入胰酶的细胞培养皿转移到倒置显微镜载物台，镜下观察细胞消化情况。对于贴壁牢的细胞，可用手指尖轻轻拍打培养皿底部，促使其脱落。待细胞大部分变圆并脱落，准备终止消化，加1-2倍体积的含10%血清培养基终止消化。

胰酶消化与血清终止原理小课堂：

细胞外含有多种胞外蛋白，如胶原蛋白以及糖蛋白，使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来，而胰蛋白酶能够催化蛋白质的特定肽键（赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽键）水解从而使得细胞从培养皿上脱落下来。而EDTA主要是通过螯合钙镁离子，钙镁离子是保持细胞间相互连接所必需的，所以没有钙镁离子，贴壁细胞之间的连接就被打开了。

所以终止时我们所加的培养基中含有钙镁离子和胎牛血清，都是胰酶抑制剂，血清终止的原理其实是竞争抑制，就是用过量的血清含有的蛋白来和胰酶结合，从而不给胰酶消化细胞外蛋白的机会。

Tips：这一步要把握好时间，切勿消化过度，及时终止消化。如果消化不够充分可以轻拍培养皿帮助细胞脱落，转移进超净台也别忘了酒精消毒哟~

⑤ 用1ml移液枪轻轻吹打混匀，使细胞脱离培养皿底部，将混合细胞悬液转移至离心管中（离心管规格根据实验需要确定），配平，500-800rpm离心3-5分钟左右。

⑥ 离心好后，轻轻取出离心管。

Tips：此时可以看到细胞在管底形成肉眼可见的细胞团块，团块大小与细胞多少有关，拿取过程中小心不要发生碰撞，把管底的细胞团块撞散，影响得率。

用酒精喷壶喷洒离心管表面，转移进超净台，打开盖子，将上清液小心倒入废液缸，加入10%血清培养基，用移液器轻轻吹打，制成细胞悬液。这就是待接种的种子啦~

Tips：弃上清的动作需一次完成，切忌抬起管口，让液体流回底部后，又再次倾倒。回流的液体会把细胞团块冲散甚至冲起来，再倾倒有把细胞团块倒掉的风险。

⑦ 根据细胞生长特性，将细胞悬液按1：2-1：5的比例分到新的培养皿中，八字手势晃匀后，置于倒置显微镜载物台，观察细胞情况。细胞喜欢扎堆，传代接种应保证一定数量，数量太少“胞二代”们会长不起来哟。

Tips：原代脂肪细胞可以少批次的传代，因其较永生化细胞更脆弱，传代密度适当提高，更有利于其生长哦。

⑧ 在培养皿上做标记，注明传代时间，细胞种类，操作人员等信息。在放入培养箱之前应再次用酒精喷一喷培养皿表面，放入培养箱后，把培养皿内的细胞再次晃动使其铺板均匀，防止生长密度不一，最后关上培养箱的门。

⑨ 传代完成啦，记得整理操作台，用75%酒精擦拭超净台台面，清理废液和垃圾，最后打开超净台内的紫外灯。

⑩ 在细胞传代前如果培养基有变黄迹象，吸去培养基，加入新鲜的含10%血清的DMEM培养基。

Tips：培养基的红色是酚红试剂的颜色，酚红试剂是一种pH指示剂，中性时为红色，碱性时为紫色，酸性时为黄色。细胞生长繁殖会消耗培养基的营养物质，分泌代谢产物，如果细胞生长旺盛，代谢活跃，产生大量乳酸和CO₂。在细胞培养48h后，培养液由红变黄说明营养物质消耗掉了，该换培养基了，此时也可以查看一下细胞密度，是否就需要传代啦~另外如果有支原体污染，也会使培养基发黄，但细胞会在几周后死亡。因此大家需要每天check好细胞状态哟~

参考文献：

【1】Eagle H et al. Nature. 1967.

【2】Abercrombie M et al. Nature. 1979

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