真菌生物膜和多种微生物疾病

【文献摘译】

作者 | 李姝

单位 | 沁阳市人民医院

摘要

生物被膜的形成是真菌的重要致病因子。酵母菌和丝状真菌都可以粘附在生物和非生物表面，发展成对抗生素和环境具有耐药性的组织化群体，目前从形态学和分子生物学角度对念珠菌生物膜的研究最为广泛。由酵母菌和丝状真菌形成的生物膜存在差异，多微生物群体的研究已变得越来越重要。耐药性的一个关键特征是细胞外基质，它覆盖并保护生物膜细菌不受周围环境的影响。此外，为了实现相互间的通信，微生物分泌群体感应分子来控制其生物活动和行为，并在真菌的耐药性和致病性中发挥作用。

01

简 介

近年来，微生物特别是细菌形成生物膜的研究得到了广泛的关注。与浮游细菌或游离细菌相比，这种生长形式在自然界中普遍存在，由于对抗生素和环境条件的耐药性增加，在临床引起关注。近年来，病原真菌形成的生物膜引起了人们的关注，丝状真菌、酵母菌和双相真菌中的一些物种能够形成群落。

02

酵母菌和丝状真菌生物膜

生物膜是一种固着的微生物群落，能够强烈地粘附在表面和彼此之间，并受到由多糖组成的多聚胞外基质(ECM)的保护。与浮游细菌或游离细菌相比，此处的细菌表现出更强的抵抗力和不同的表型，并与感染的持续性有关。病原菌还可以粘附在假体和导管等非生物表面，酵母菌利用这种进入血液循环，到达患者的内部器官。

酵母菌和丝状真菌都能形成生物膜;然而，与酵母菌相比，丝状真菌生物膜的研究有限。这是因为一段时间以来，丝状真菌形成的生物膜并不符合之前关于细菌生物膜的定义。因此，作者提出了丝状真菌生物被膜形成的模型，表明尽管形态不同，但该模型与细菌和酵母菌的生物被膜形成相似。

丝状真菌生物膜的发展阶段如图1a所示，包括繁殖体吸附(I)，包括孢子、菌丝碎片或孢子囊与表面的接触;活性粘附(II)，其中粘附素由孢子在萌发和其他生殖结构中分泌;第一个小菌落形成(III)，包括延伸和菌丝分支，形成一个单层与细胞外基质的生成;第二微菌落形成或初始成熟(IV)，其中紧密的菌丝网络形成三维，由细胞外基质覆盖，并形成水通道;最终成熟(V)，其中子实体和其他幸存者结构的形成取决于真菌;最后，散布或浮游阶段(VI)，在这个阶段，分生孢子和/或菌丝碎片被释放，开始一个新的周期。丝状真菌的另一个特性是分泌被称为疏水蛋白的小蛋白质。这些蛋白参与菌丝粘附疏水表面，并可能参与生物被膜的形成。

图1所示。丝状真菌(a)和白念珠菌(b)的生物被膜发育模型。虽然发育阶段的形态和数量不同，但它们的发育阶段相似。在第一个模型(a)中，由Hardingetal.提出了六个阶段:(I)吸附;(II)活性附着;(III)通过萌发和/或单层发育首次形成小菌落;(IV)菌丝发育;第二种模型对应于经典白念珠菌生物膜的形成(b)，包括5个阶段，如在细菌中:(i)吸附，(ii)粘附，(iii)微菌落形成，(iv)成熟生物膜，(v)分散

对于酵母菌而言，白念珠菌是研究最多的生物被膜形成模型，其具有与细菌生物被膜相似的不同发展阶段。与丝状真菌相比，其过程涉及较少的发育阶段，包括酵母细胞在表面的吸附(i);其次是最初的粘附(ii)，形成的基础层酵母与早期发展的菌丝和细胞外基质(iii);生物膜成熟，包含大量的酵母、菌丝、假菌丝、细胞外基质和允许营养物质移动的水通道(iv)和细胞分散。

近年来，有关真菌生物膜的研究显著增加，一些物种已经显示出形成这些群落的能力。巴西副球孢子菌是一种引起副球孢子真菌病的双相真菌，在拉丁美洲流行。Sardietal.对该真菌在酵母期形成的生物膜进行了研究，发现体外群落形成与GP43、烯醇酶、GAPDH、天冬氨酸蛋白酶等黏附素和酶的基因表达增加有关，而磷脂酶的表达减少。荚膜组织胞浆菌生物膜最早由Pitanguiet al.描述,这种真菌也具有热双相性，引起组织胞浆菌病，一种呼吸性和系统性真菌病，其进化依赖于肺泡巨噬细胞中酵母的生存和复制。

浅部真菌是侵入角质组织产生皮肤真菌病的真菌，是人类和动物中最常见的皮肤真菌病之一。在皮肤真菌病中，甲真菌病经常复发，需要长期治疗，有时无效，Costa-Orlandi等人证实了红色毛癣菌和须癣毛癣菌的体外生物被膜形成。

在病原真菌方面，自20世纪90年代中期以来，人们就对念珠菌形成的生物膜进行了研究。体外实验优于体内实验，证实了这些生物膜的异质性，这些生物膜由密集的酵母出芽、菌丝、假菌丝和ECM层组成。一些基因参与生物膜的粘附、ECM的产生、群体感应和形态发生，特别是在白念珠菌中。此外，遗传分析证实，酵母和菌丝在该物种的生物被膜形成中都有独特的作用。研究表明，大多数成丝过程与生物膜的压缩力增加直接相关，这使得生物膜对涡流和超声波等不利条件有更强的抵抗力。

分析光滑念珠菌、假丝酵母菌和热带念珠菌生物膜ECM的形成、形态和组成的差异。从形态上看，部分假丝酵母菌生物膜由酵母和假菌丝组成，而其他菌株的生物膜仅由酵母细胞组成，热带念珠菌的生物被膜大部分仅由酵母细胞组成，只有少数菌丝较长，而光滑念珠菌的生物被膜中仅含有酵母细胞。在基质组成方面，三种物种的生物膜显示出不同数量的碳水化合物和蛋白质。

曲霉菌属是腐生真菌和机会性致病真菌，它们分泌酶、蛋白质和代谢物，形成严重的浅表和全身感染。曲霉菌病被认为是医院感染的第二大原因，仅次于白念珠菌，死亡率高。在免疫功能低下或免疫功能正常且有肺病病史的个体中，可引起曲霉球、侵袭性肺曲菌病、过敏性支气管肺曲菌病，甚至全身播散。

曲霉菌病是一种具有生物膜特征的真菌团，与念菌生物膜一样，近年来对这些丝状真菌形成的生物膜进行了广泛的研究，这些生物膜可以在非生物表面发育。Mowat等的一项研究表明，这些生物膜在24小时内达到成熟。在成熟时，生物量密度增加，菌丝之间形成通道，允许液体和营养物质通过。ECM由α-1,3-葡聚糖、黑色素、疏水蛋白、半乳甘露聚糖、单糖、多元醇和抗原组成。

03

多微生物生物膜

微生物很少以单种浮游形式存在。大多数微生物生活在复杂的群落中，称为多微生物生物膜。与大多数群体类似，生物膜是多元和精心设计的。这些生物膜内的相互作用可以是互惠的、共生的或拮抗的，微生物已经进化出高度的反应来感知和适应邻近的物种。

在健康和疾病状态下，多种微生物生物膜在人体各处普遍存在。然而，临床对多微生物生物膜协同作用的担忧是，感染会更加严重，难以治疗。微生物协同作用是两个或多个种之间的合作相互作用，产生单个种无法单独实现的效果。这些协同作用比单个微生物感染更为严重，导致抗菌素耐药性增加，延长了宿主恢复所需的时间。

生物膜群落的遗传多样性增加了群落的适应能力，使物种能够更好地适应环境压力，从而加速生长、增强耐药性、免疫逃避、被动抵抗和代谢合作。

与多微生物生物膜相关的感染最常出现在尿路、肺、内耳、尿路、口腔、伤口和非生物装置中。这些部位的生物膜可增强感染并诱发慢性炎症状态，导致宿主组织的损害，这和生物膜的结构有助于保护微生物免受抗生素、宿主免疫和环境因素的影响相关。

近年来，随着技术的发展，对多种微生物感染在人类真菌病中的重要性有了更深入的认识。真菌与多种微生物的相互作用在各种疾病状态和生态位中都很重要，包括呼吸系统感染、牙菌斑的形成、侵入性疾病、皮肤和粘膜感染以及血流感染。

最近的研究表明，念珠菌很少以单种形式存在，可在人体的粘膜表面和义齿、导管等修复材料上定植。此外，由其他真菌和细菌聚集物组成的多微生物群落是非常普遍和重要的。

口腔念珠菌病是一种明确的真菌生物膜感染，具有复杂的生物膜特征，与细菌和宿主相互作用。念珠菌与链球菌之间的关系通常被认为是协同作用的，链球菌感染通过细胞表面黏附素SspB与菌丝细胞壁蛋白Als3相互作用，与念珠菌菌丝发生相互作用。

有研究表明，细菌可增强白念珠菌的生物被膜形成和致病性。在这种相互作用中，链球菌向假丝酵母菌提供来自唾液膜的营养物质，而假丝酵母菌则通过降低供链球菌生长所能接受的氧张力水平，并提供刺激细菌生长的营养物质来促进链球菌的生存。

金黄色葡萄球菌和白念珠菌组成的生物膜已被广泛研究，这两种微生物经常在不同类型的感染中同时发现，它们在同时感染宿主后表现出更强的毒力和耐药性。金黄色葡萄球菌和念珠菌是两种最常见的血液病原体，并导致住院患者严重的发病率和死亡率。

有一些证据表明，它们通常是共同感染的。除了血流外，白念珠菌和金黄色葡萄球菌也被从包括阴道和口腔粘膜在内的各种粘膜表面以生物被膜的方式分离出来。Peters等人用蛋白质组学方法鉴定了白念珠菌与金黄色葡萄球菌相互作用过程中上调的蛋白，结果表明两种菌在最初的相互作用中都能诱导应激反应，尤其是当念珠菌仍处于酵母形态时。

此外，虽然对念珠菌混合生物膜的研究较少，但也有一些报道。Coco等报道了从严重炎症患者中分离出白念珠菌和光滑念珠菌合并感染，并假设存在致病性协同作用。进一步的研究证实了这种协同作用，其中白念珠菌似乎有助于光滑念珠菌侵入体外上皮。在另一种与人类阴道上皮相对应的模型中，光滑念珠菌与白念珠菌联合作用比单独光滑念珠菌引起显著的组织损伤。

最近，Martinset al.报道了含有白念珠菌和皱褶念珠菌的混合生物膜的体外形成，皱褶念珠菌是在拉丁美洲，特别是巴西发现的一种新出现的真菌病原体。皱褶念珠菌对氟康唑、两性霉素B和棘白菌素的敏感性较低，常出现在能形成生物膜的老年患者身上。Kirkpatrick等也描述了白念珠菌和都柏林念珠菌形成的混合生物被膜，表明在浮游生长条件下，白念珠菌相对于都柏林念珠菌具有明显的竞争优势，而在生物被膜生长条件下，都柏林念珠菌能够更好地抵御来自白念珠菌的严峻竞争压力。

其他真菌种类也在体外作为多微生物生物膜的一部分。在囊性纤维化(CF)患者的肺部、开放性皮肤伤口和心脏植入物中，通常发现烟曲霉和其他曲霉与铜绿假单胞菌共定植。

Manavathu等人在体外证明，铜绿假单胞菌和烟曲霉感染的CF患者气道会产生结构和功能特征不同于假单胞菌生物膜的混合微生物生物膜，这是CF患者及其他易感染铜绿假单胞菌和烟曲霉的患者的一个严重的临床问题。Zheng等人证明铜绿假单胞菌产生的非那嗪衍生代谢产物可作为影响烟曲霉和构巢曲霉发育的信号，随着非那嗪梯度的降低，从微弱的营养生长转变为诱导的无性产孢(分生孢子)，影响生物被膜的形成。

许多研究已经报道了真菌和细菌在不同疾病中的联合感染。例如，囊性纤维化的肺是多种微生物感染的主要部位，细菌如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、洋葱伯克霍尔德菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌与白念珠菌、烟曲霉和赛多孢菌混合。然而，还需要更多的研究来了解这些相互作用是如何发生的，并确定这些感染中生物膜的参与。

在其他感染部位，真菌和细菌之间的多种微生物相互作用已经描述。例如，念珠菌与链球菌和乳酸杆菌的相互作用;口腔部位牙龈卟啉单胞菌;烧伤创面及创伤部位念珠菌、曲霉、毛霉、镰刀菌及假单胞菌、葡萄球菌;念珠菌和隐球菌与广泛的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌在下生殖道;革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌与皮肤部位和血管、导管、皮肤真菌之间的相互作用，肠杆菌科和肠球菌属与腹内部位假单胞菌属的相互作用，最后，肠杆菌科，大肠杆菌和粪肠球菌与念珠菌存在于尿路。念珠菌与大肠杆菌、幽门螺杆菌、粘质沙雷氏菌和肠道沙门氏菌亚种之间的胃肠道和肠道相互作用。

参考文献：

CarolineB. et al.FungalBiofifilms and Polymicrobial Diseases.J.Fungi 2017,3,22; doi:10.3390/jof3020022

END

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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼