《食品科学》：海南大学园艺学院曾教科博士：黄皮转录组测序及抗氧化相关基因的挖掘

黄皮果实风味独特，具有较高的营养价值，可鲜食、加工以及药用，因而深得消费者喜爱。黄皮前期的研究主要集中在种质资源和生理生化，包括采前品种的形态和理化性状、物候期、抗性、种质资源和育种等方面，采后的营养物质和生物活性功能，以及采后保鲜处理技术等。而对黄皮果实分子层面的研究甚少，目前主要集中在一些基因的克隆及分子标记等方面。

本实验前期的研究结果也显示，采后热激（HT）和程序降温（LTC）处理可以有效提高抗氧化酶SOD、PAL和POD等活性，从而抑制黄皮果实褐变，维持果实品质。但是，对黄皮抗氧化酶编码基因的研究报道较少，研究进展缓慢，因此，有必要通过转录组学技术挖掘黄皮果实抗氧化酶编码基因。

海南大学园艺学院的刘照宇、刘新婷、曾教科*等人采用转录组测序技术，对HT（50 ℃/30 s）、LTC（8 ℃/4 d）和对照（CK）（3 ℃）处理后3 ℃贮藏至第6天的黄皮果实进行测序，拟从转录组水平分析黄皮果实在不同处理技术下基因的表达差异，进而对DEGs进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，同时筛选出抗氧化相关的DEGs，旨在为今后黄皮果实褐变的调控研究和品质维持提供一定的理论基础。

1、HT和LTC处理对黄皮果实质量损失与褐变的影响

由图1可知，黄皮的质量损失率和褐变指数随贮藏时间延长整体呈上升趋势，LTC处理可以显著降低黄皮贮藏期间的质量损失率，而HT处理与CK相比差异不显著（图1A）。与CK相比，LTC处理也可以显著降低黄皮果实褐变指数，而HT处理的黄皮果实在贮藏第6天后才有显著差异（图1B），因此，LTC处理是一种有效的抑制黄皮果实失水和褐变的调控措施。

2、HT和LTC处理对黄皮果实抗氧化酶和抗氧化活性的影响

由图2可知，随着贮藏时间的延长，黄皮果实抗氧化酶活性均有不同程度的升高。CK组果实SOD和POD活性在贮藏第6天达到峰值，之后开始下降，至贮藏第8天时，明显低于HT和LTC处理组果实。CK组果实CAT活性和DPPH自由基清除率则在贮藏第4天达到峰值，至贮藏第6天开始，显著低于HT和LTC处理组果实。说明HT和LTC处理可显著推迟抗氧化酶和抗氧化活性高峰的出现，维持黄皮果实贮藏中后期较高的抗氧化性能，从而延缓褐变的进程。

3、RNA样品质量检测

根据测序公司要求，对提取的RNA样品进行浓度、纯度和完整性检测。如图3所示，所有RNA样品的OD 260 nm /OD 280 nm 值在1.8～2.1之间，RNA完整值高于6.5，28S/18S核糖体亚基比率大于1。样品检测符合测序公司要求，可进行cDNA文库构建及转录组测序。

4、转录组测序数据组装及分析

黄皮转录组测序共获得348 795 114 条原始reads，平均每个文库29 066 260 条；筛选过滤后获得345 649 476 条clean reads，占原始reads中99.1%，平均每个文库28 804 123 条，每个文库都产生超过3 G的clean bases，Q 20 的比例都超过96%，Q 30 都超过90%，说明测序质量较好。通过Trinity进行de novo组装后，从12个文库中共得到35 421个转录本，N 50 为1 744 bp，平均长度为1 208 bp，GC占比41.14%；获得27 353 条Unigene，N 50 为1 731 bp，平均长度1 138 bp，GC占比41.33%。其中在CK、HT和LTC中均表达的Unigene有20 219 个。

5、Unigene功能注释及分析

将四大数据库注释的Unigene通过Venn图分析不同Unigene与数据库之间的关系。分析得出，不同数据库都注释到的Unigene数为6 533 条，占注释Unigene总数的23.9%（图4A）。

21 696 条Unigene被至少一个数据库成功注释，占全部Unigene的79.32%。Nr数据库比对注释获得的Unigene数最多，有21 658 条，占了Unigene总数的34%。其中有15 841 条Unigene比对到Swissport数据库。用于KEGG途径和KOG分析的分别有8 044 条和13 097 条Unigene（图4B）。

转录本注释比例均高于Unigene，说明大部分基因得以注释（图4C）。

37.95%的Unigene（10 381）与脐橙（Citrus sinensis）基因序列相似，其次是可可（6.59%，Theobroma cacao，1 802）和土瓶草（5.15%，Cephalotus follicularis，1 408）（图4D）。可注释基因绝大部分来自于同属芸香科的脐橙和同为热带植物的可可，注释结果可靠性较高。

6、DEGs筛选结果

由图5可知，CK-0 d vs CK-6 d，共筛选出9 342个DEGs，其中CK-6 d组相对于CK-0 d组下调表达基因3 800 个，占总差异表达40.7%，上调表达基因5 542个，占总差异表达59.3%。CK-6 d vs HT-6 d，共筛选出1 631个DEGs，其中HT-6 d下调表达基因754个，占总差异表达46.2%，上调表达基因877个，占总差异表达53.8%。CK-6 d vs LTC-6 d，共筛选出5 404个DEGs，其中LTC-6 d下调表达基因3 097个，占总差异表达57.3%，上调表达基因2 307个，占总差异表达42.7%。

7、DEGs GO富集分析

由图6可知，对CK-0 d vs CK-6 d、CK-6 d vs HT-6 d、CK-6 d vs LTC-6 d进行显著富集，发现3 组比较中DEGs在分子功能、生物过程和细胞组成三大功能类别均有分布。3 组比较产生的DEGs在GO富集分析中呈现一定共性，在生物过程类别中，DEGs主要富集在代谢过程、细胞过程、单细胞体过程；在细胞组分中，DEGs主要富集在细胞、细胞膜、细胞器；在分子功能中，DEGs主要富集在催化活性、结合。DEGs在代谢过程、细胞器、催化活性等的功能分类，说明HT、LTC处理改变了黄皮果实内部的代谢和酶的催化功能。

8、DEGs通路显著性富集分析

如表2所示（点击下方 阅读原文 即可查看表2），3 组比较中都显著富集的代谢通路有信号转导、糖代谢和次生代谢产物生物合成等，这些途径大多与黄皮果实采后生理代谢相关。并且，苯丙素生物合成、黄酮类化合物的生物合成和植物激素信号转导等途径与黄皮果实抗氧化物质代谢相关，可能参与了黄皮果实采后氧化褐变调控。

9、抗氧化相关基因筛选与差异表达

PAL、SOD、CAT、POD、APX、GR、GPX和GST等为常见的抗氧化酶编码基因，在抑制果实褐变、品质劣变等方面起着重要的作用。为了进一步分析在不同处理条件下诱导差异表达的抗氧化酶编码基因，在转录组数据中筛选出了76个抗氧化相关DEGs（图7），其中，CK-0 d vs CK-6 d比较有62个抗氧化相关基因，CK-6 d相对于CK-0 d下调基因17个，上调基因45个；CK-6 d vs HT-6 d比较有7个抗氧化相关基因，HT-6 d下调基因4个，上调基因3个；CK-6 d vs LTC-6 d比较有31个抗氧化相关基因，LTC-6 d下调基因24个，上调基因7个；HT-6 d vs LTC-6 d比较有34个抗氧化相关基因，LTC-6 d下调基因26个，上调基因8个。

利用基因表达量热图，进一步分析这76个抗氧化相关基因的差异表达模式（点击下方 阅读原文 即可查看图8）。结果显示，第I、II类基因均在黄皮贮藏过程中下调表达，说明这两类基因可能与黄皮果实采后正常衰老过程有关。与CK相比，HT和LTC处理均显著抑制了第IV类基因（1个PAL基因、4个POD基因、1个GPX基因、7个GST基因）表达的上升，并与黄皮果实贮藏前期抗氧化酶活性的变化趋势一致；相关性分析表明，第IV类基因与抗氧化活性（DPPH自由基清除率）呈负相关或相关性较小，而与褐变指数正相关（图8B），说明第IV类基因可能通过降低贮藏前期抗氧化活性强度，从而维持贮藏中后期较高的总抗氧化活性，达到延缓褐变的效果。HT处理显著诱导第V类基因（1个CAT基因、1个POD基因、3个GST基因、1个APX基因）的上调表达，LTC处理显著诱导第VII（3个POD基因、2个SOD基因、1个GST基因）和X类基因（2个POD基因、2个APX基因、1个GST基因、1个GPX基因）的上调表达。

结论

结果表明，这76个基因的表达模式可以聚为10 类。HT和LTC处理通过抑制第IV类基因表达的上升，降低黄皮果实贮藏前期抗氧化活性强度，从而维持贮藏后期较高的总抗氧化活性延缓褐变的发生。HT和LTC处理分别通过诱导第V类和第X类基因的表达，增强贮藏后期抗氧化活性，从而达到延缓褐变发生。因此，HT和LTC分别通过不同的途径提高黄皮果实贮藏过程中的抗氧化能力，其中第IV、V、X类基因可能为抑制黄皮褐变的关键基因。本研究为黄皮的品种选育和品种改良等提供理论基础。

本文《黄皮转录组测序及抗氧化相关基因的挖掘》来源于《食品科学》2022年43卷2期199-209页，作者：刘照宇，刘新婷，白新宇，李雯，曾教科。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201110-105。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年5月7-8日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。