19 世纪 80 年代，人们发现，比起牛奶喂养的婴儿来说，使用母乳喂养能够有效提升婴幼儿的抵抗力。到了 20 世纪 50 年代， Gyorgy 和 Kuhn 合作证明了人类乳汁中存在一些能促进乳酸菌和双歧杆菌生长的寡糖，而在牛乳中则几乎不存在。
后来，科学家们将人乳中具有益生作用的寡糖称为人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）。
可以说，HMOs 化合物的存在是人乳与牛乳成分上的一个主要差异。
HMOs 具有多种生物学功能。虽然大部分 HMOs 不能在婴儿的小肠内被消化吸收，但其进入结肠后可作为益生元刺激双歧杆菌等对人体健康有利的微生物生长；还可作为受体类似物，抑制致病微生物对结肠黏膜的黏附；此外，小部分人乳寡糖可以被吸收进入血液循环系统作为免疫调节因子。
这些功能有利于婴儿肠道建立正常的消化和吸收、分泌及免疫功能，更有利于婴儿神经系统发育，并可降低免疫相关的非传染性疾病的发生。
（来源：Nature）
均质化合成是难题
随着近年来人造母乳的逐渐兴起，大规模且高效的合成方法成为了研究人员关注的焦点。其首要挑战就在于如何有效合成均质的 HMOs。
作为人乳中含量仅次于乳糖（55−70 g/L）和脂类（15−40 g/L）的第三大成分，HMOs 是一类包含 200 多种不易消化且非营养性的低聚糖混合物。目前，通过光谱、质谱等技术，已完成其中 150 余种化合物的分析表征。
不过，用于构建 HMOs 的基本单体仅有五种。在人体乳腺中，以 12 种独特的糖苷键为合成核心，将五种单糖通过不同方式结合于乳糖结构上，再通过对主链结构进行修饰，形成结构复杂的各种低聚糖。
图丨构成 HMOs 的基本单体（来源：JACS）
尽管种类繁多，但其中常见的 10-15 种化合物占据 HMOs 总量的一半。按照修饰基团的不同，母乳中的 HMOs 大致分为3种类型：岩藻糖基化或非岩藻糖基化的中性 HMOs，唾液酸化的酸性 HMOs。
图丨12种糖苷键结构；常见 HMO（来源：JACS）
在这其中，中性 HMOs 占总量的75%以上。目前研究最为广泛的则是2′-岩藻糖基乳糖（2'-FL），在母乳中分泌最为丰富，约占总 HMO 的30%。
此前，借助色谱法、纳滤法、固相萃取法等手段分离天然 HMOs 是该类化合物的制造方法。但由于 HMOs 异构体较多，所制备的寡糖纯度较低，常以混合物形式存在；部分衍生处理还会破坏天然 HMOs 的结构；最重要的是，人乳来源本就稀少。因此，分离提纯并不是解决母乳制造问题的有效途径。
基于合成生物学的大规模发酵生产
在合成生物学的时代到来之前，有效合成 HMOs 是一个充满挑战的长期课题。
自 1999 年 Aly 等人利用化学合成法合成了乳酰-N-四糖（LNT）和乳酰-N-新四糖（LNnT）以来，该课题先后发展出了利用化学法合成、酶法合成以及基于细胞发酵法的合成生物学等各类合成方法。
上述提到的首个化学合成法历经 34 步反应，最终的 LNT 和 LNnT 产出率仅为 0.6%。不过经历了一系列发展，到了 2016 年，基于酶类的合成法达到了95%的产出率。
不过，化学合成法反应条件严苛，且成本昂贵；与之相比，酶法合成虽然有较好的产出率，但是必需酶与受体的价格同样昂贵。且酶促反应中，酶的稳定性、催化效率、底物和受体的耐受程度等均会对制造产生影响，该方法也难以实现大规模生产。
近年来，随着合成生物学的不断发展，利用微生物合成发酵进入了快速发展阶段。对于母乳合成来说，微生物合成发酵就是直接在微生物细胞内，利用其自身或基因工程实现酶类的过表达或异源表达，从而合成寡糖。
由于 HMOs 种类和结构的不同，其合成发酵的途径也各不相同。
目前，研究较多的是以大肠杆菌（E. coli）作为模式微生物。通过基因工程在 E. coli 中构建并表达反应酶，从而代谢产出 GDP-岩藻糖（GDP-Fucose）。该化合物是岩藻糖基化寡糖生物合成中的关键中间体，在 α-1,2 岩藻糖基转移酶的作用下，与乳糖进行基团置换形成 2'-FL。
图丨用于制造 HMOs 的微生物细胞工厂（来源：JACS）
基于该合成途径，通过更换酶类即可获得另一种岩藻糖基化寡糖 3-FL。2′-FL 和 3-FL 作为 HMOs 中结构相对简单的低聚糖，在母乳中含量丰富。迄今为止，基于微生物发酵法生产 2'-FL 和 3-FL 所达到的最高报告滴度分别为180 g/L 和 35 g/L。
除岩藻糖基化 HMOs 获得广泛研究之外，唾液酸化 HMOs 的合成同样获得进展。该类化合物中，唾液酸乳糖的含量最高，包括 3′-SL 和 6′-SL，其浓度可达 980 nmol/mL。
以上两种化合物均以唾液酸和乳糖作为前体物质，再分别通过 α-2,3 或 α-2,6 糖苷键连接形成 3′-SL 和 6′-SL。
早在2008年，Fierfort等即使用 E. coli 作为宿主微生物，通过基因编辑技术构建相关代谢通路。以乳糖为底物生成 3′-SL，产量达到了25 g/L。目前，已经成功开发了以更低成本底物，例如利用甘油和乳糖有效合成 3′-SL 和 6′-SL 的方法。
现阶段来说，通过使用大肠杆菌进行微生物发酵已经表现出大规模合成 HMOs 的潜力，或将在未来成为商业化生产的一种方式。不过仍有部分问题亟待解决。
例如，发酵罐内的环境变量难以控制，例如 pH 值、碳源和氧气水平等。这些变量将会对微生物产生负面影响。除此之外，来自大量微生物生产者的遗传不稳定性也是问题之一。
目前，已获得监管机构批准通过微生物发酵法合成的 HMOs 分子包括 2'FL、LNnT、DFL 和 LNT。随着科学的进一步发展，多种类 HMOs 的合成研究会越来越完善，市场化规模的生产将逐步走向成熟。
寡头分割HMOs市场
根据美国联合市场研究（Allied Market Research）机构的报告，2020 年全球 HMOs 行业产值 1.259 亿美元，预计到 2028 年将达到 3.326 亿美元，自 2021 年至 2028 年复合年增长率为 14.1%。
图丨国外HMOs主要制造商（来源：CB Insights）
从应用角度来看，其市场份额仍以婴儿配方奶粉市场为主，占全球 HMOs 市场的一半以上。此外，功能性食品补充剂、药物制备也是新兴发展方向，不断有研究涌现。
目前，HMOs 制造领域内的领先席位被众多国外知名制造企业所占据，形成“群雄割据”的场面，包括雅培实验室、巴斯夫公司、杜邦营养与生物科学、Chr.Hansen Holding A/S、雀巢健康科学和荷兰皇家帝斯曼等。
纵观全球，HMOs 的生产厂家不超过 20 家，近几年，上述企业纷纷通过收购 HMOs 生产商或者合作的方式，扩充自己的产品版图。
杜邦与 Inbiose 合作
2017 年，杜邦公司与 Inbiose 基于微生物发酵技术制备 2'-FL 的技术共同获得欧盟批准。
成立于 2013 年的比利时生物技术公司 Inbiose，专注于特种碳水化合物的研究、开发和商业化。其专有技术平台“ GlycoActives® ”能够通过可持续发酵工艺经济高效地制造各种特种碳水化合物，也包括 HMOs。
2021 年 7 月，Inbiose 从欧洲投资银行贷款 1767万 美元，同月，Inbiose 向美国食品和药物管理局提交四种人乳寡糖的申请，包括 6'SL、 3'SL、 LNT 和 LNnT。Inbiose 预计将在 2022 年获得这些成分的监管批准，目前正在工业化生产，以便及时向婴儿营养、膳食补充剂和功能性食品和饮料的客户交付。
巴斯夫和 Glycosyn 战略合作
2019 年 5 月 ，巴斯夫和 Glycosyn 签署了一项合作协议，开发和商业化人乳寡糖，以广泛用于膳食补充剂、功能性营养品和医疗食品。Glycosyn 将肠道健康专利组合独家授权给巴斯夫。
Glycosyn 是一家专门从事 HMOs 开发的生物技术公司， 开发基于HMOs的产品，用于婴儿、儿童和成人营养、治疗和诊断领域，拥有使用 HMOs 改善成人胃肠健康（肠易激综合征和炎症性肠病）的独特知识产权和专有技术。
皇家帝斯曼收购 Glycom
2020 年 2 月 24 日，Glycom 被荷兰皇家帝斯曼集团以 8.27 亿美元的价格收购。
Glycom 是人乳寡糖 (HMOs) 市场的全球领先供应商，也是唯一一家拥有自己的产品开发、临床前和临床开发、监管和大规模生产的完全整合的 HMOs 参与者。
Glycom拥有近百项专利，除了碳水化合物合成专利外，也布局了医药健康产业，Glycom领导了丰富的临床前和临床研究计划，以验证人乳寡糖对人类健康的影响，例如HMOs 对肥胖儿童和肠易激综合征 (IBS) 患者的影响。
图丨Glycom专利分布情况（来源：CB Insights）
目前，帝斯曼旗下产品范围包括全部四种获批的 HMOs 分子：2'-FL、DFL、LNnT 和 LNT。另外，其团队正在不断拓展 GlyCare™ 人乳寡糖产品管线，预计能够生产所有 200 余种 HMOs 中的 75% 以上。
图丨部分在研产品（来源：帝斯曼）
科汉森收购 Jennewein
2020 年 9 月，Chr.Hansen Holding A/S（简称“科汉森”）收购HMOs市场的领先企业 Jennewein Biotechnologie GmbH（简称 “Jennewein”）。此次收购完全符合科汉森进行补强式收购扩展和加强其微生物和发酵技术平台的 2025 Strategy 战略。
Jennewein 创立于 2005 年， 是一家位于德国莱茵布赖特巴赫的工业生物技术公司，生产一系列 HMOs 产品，如 2'-岩藻糖基乳糖、3'-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-四糖，用于食品行业（特别是婴儿配方奶粉）、制药行业和化妆品行业。
深度细分领域市场追求合作共赢
反观国内市场，HMOs 的合成正处于研发阶段，将其工业化生产的公司寥寥无几。巨头环伺之下，国内公司势必有一场硬战要打。
图丨国内HMOs生产商（来源：生辉根据公开资料整理）
“一方面，HMOs 是一个深度细分的市场，现阶段国内真正能实现产业化的公司并不多。另一方面，HMOs 也是一个To B 的产品，竞争的关键在于技术和成本。”一兮生物创始人兼首席执行官刘振云告诉生辉SynBio ，这是一家尝试用生物合成方法量产 HMOs 的初创公司。
刘振云指出，一兮生物降低成本的核心在于基因电路的设计和组装，如果这一步做好，相应的得率也会提升。据悉，目前，一兮生物生成的 HMOs 成分得率比较高，加上中国的产业链、人力成本、其他方面的优势，预计可以将生产成本降低 50%。
2019 年江南大学陈坚团队做了一次成本核算，唾液酸的从头合成和全细胞催化成本分别为 121.9 美元/千克和 140.0 美元/千克，2019 年市场价格为 774.2 美元/千克。根据当时市场价格的计算，从头合成的 8.3 g/L产量和全细胞催化的 127.6 g/L产量可用于商业化生产。
图丨唾液酸和唾液酸乳糖生产成本（来源：X. Zhang, et al. Biotechnology Advances 37 (2019) 787–800）
在刘振云看来，合作共赢是降低成本的另一个重要手段。“大公司的优势在于销售渠道，小公司在面对大公司的竞争时，可以适当采取合作的战略，而前提还是需要把成本降得足够低。”
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