固相萃取光谱法测定水及肉制品中痕量亚硝酸钠

硝酸盐与亚硝酸钠是常见的含氮化合物，广泛存在于人类生活环境中。人体内硝酸盐在微生物作用下可还原成亚硝酸钠，是N-亚硝基化合物的前体物质。亚硝酸钠的外观及滋味都与食盐相似，并在工业、建筑业中广为使用，在肉类制品中也允许作为发色剂限量使用。但是由亚硝酸钠引起食物中毒的机率较高。食入0.3～0.5 g的亚硝酸钠即可引起中毒，3 g可导致死亡。GB 8537—2008《饮用天然矿泉水》规定了饮用天然矿泉水中亚硝酸钠质量浓度不得超过0.1 mg/L。

华东理工大学 上海市功能性材料化学重点实验室的李超逸、李 龙、杜一平*等人曾开发了膜富集-在线漫反射光谱检测的装置和分析方法，称为固相萃取光谱（SPES）技术。该技术在被测组分富集后不经洗脱而在固相材料上直接测定固相光谱，方法简单、快速、灵敏，选择性往往也能得到提高。本实验采用SPES技术，对亚硝酸钠的衍生产物富集后直接进行漫反射可见光谱的检测，大幅提高了检测方法的灵敏度，实现痕量亚硝酸钠含量的快速测定；所建立方法具备快速、便捷，仪器结构简单、操作方便、价格低廉的特点，适用于水质以及肉制品中亚硝酸钠离子的快速检测和现场检测。

1、衍生化反应产物的表征

对于衍生化产物，采用基质辅助激光解析-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对其分子质量进行确定（图2），并用拉曼光谱对—N＝N—偶氮化合物骨架进行验证（图3）。质谱图中m/z 327.1的谱峰，由于在负离子模式下，磺酸基的氢离子容易失去，与目标偶氮化合物2a或2b的分子质量（328.1 Da）相符；拉曼光谱中1 455.55 cm －1 峰为—N＝N—骨架的特征峰，该峰对应的偶氮化合物可能具有对位（2a）或邻位（2b）的取代结构。

2、衍生化反应条件的优化

偶氮化合物溶液pH值的选择

pH值对偶氮化合物的结构以及合成有很大的影响，酸性条件下1-萘酚上羟基的氢不易脱落，溶液呈现橙红色；碱性条件下羟基上的氢容易失去形成氧负离子，与萘环的大共轭π键相互作用，溶液呈现玫红色，同时碱性条件下的产物较复杂，副产物较多。因此，pH值的影响结果如图4所示，在pH 4.74时，膜上偶氮化合物获得最大的吸光度，后续选择pH 4.74的缓冲体系进行实验。

反应时间的选择

亚硝酸钠和对氨基苯磺酸的重氮反应较为快速，常温下2～8 min即可反应完全；但重氮盐和1-萘酚的反应程度则和反应时间有关。因此，设计实验考察3 个质量浓度的待测液，从加入衍生化试剂及缓冲溶液后开始实时监测溶液的吸光度，从而获得反应时间对吸光度的影响，平行3 次，如图5所示，随着反应时间延长，溶液吸光度逐步增高，到15 min吸光度恒定不变。后续实验中第2步反应时间选择15 min。

衍生化试剂用量比例的确定

由图6可知，当亚硝酸钠和对氨基苯磺酸用量比为1∶3时吸光度最高，误差较小，且有两条线在该处的吸光度相近，亚硝酸钠和1-萘酚比例1∶3和1∶7。考虑到节约试剂与保护环境的因素，后续实验选取亚硝酸钠和1-萘酚比例为1∶3。综合考虑，选择亚硝酸钠-对氨基苯磺酸-1-萘酚物质的量比为1∶3∶3。

3、膜富集实验条件优化

微孔滤膜种类的选择

如图7所示，Nylon-A和Nylon-B两个厂家的尼龙膜对偶氮化合物有较好的富集效果，同时不同厂家的滤膜吸光度相差不大，但Nylon-B偏差较小。其他种类的膜材料或没有明显富集效果或光谱信号很弱。后续实验中选择Nylon-B对偶氮化合物进行富集。

富集溶液体积的选择

结果如图8所示，随着样品体积从1 mL增加到7 mL，偶氮化合物472.5 nm波长处的吸光度明显增加。当样品体积从7 mL增加到15 mL时，偶氮化合物的吸光度增加不明显。同时，由于溶液体积位于15 mL和20 mL时，误差较大，故而选择溶液体积为10 mL为后续实验的样品溶液过膜体积。

4、漫反射光谱检测条件优化

亚硝酸钠溶液和对氨基苯磺酸和1-萘酚反应过后的酸性溶液先采用分光光度法测定其溶液特征峰，再富集到尼龙膜上测定漫反射光谱，2 种光谱图如图9所示，与文献结果相符，后续实验选择472.5 nm为分析波长。

5、标准曲线和检出限

在优化好的条件下，通过富集系列质量浓度与衍生化试剂反应得到的偶氮化合物标准溶液，探究亚硝酸钠质量浓度在0.002～0.030 mg/L时与吸光度之间的关系。在0.002～0.030 mg/L质量浓度的范围内，富集产物的最大吸光度与亚硝酸钠质量浓度呈二次函数关系y=－268.76x 2 +14.55x+0.03，R 2 =0.999；在0.002～0.014 mg/L质量浓度范围内，富集产物的最大吸光度与亚硝酸钠质量浓度呈线性关系y=11.02x+0.03，R 2 =0.991。

利用9 次空白样品计算其标准偏差，按3 倍标准偏差估算得出本实验方法的检出限为1.29 μg/L，定量限为4.30 μg/L。

标准溶液的检出限为1.29 μg/L，根据自来水样品前处理的计算，自来水的方法检出限为12.90 μg/L，定量限为43.00 μg/L；根据培根样品前处理的计算，培根的方法检出限为1.29 mg/kg，定量限为4.30 mg/kg。

6、实际样品的检测结果

自来水中亚硝酸钠的检测

如表1所示，亚硝酸钠在自来水中的回收率在91.3%～114.0%的范围内，5 次平行实验的相对标准偏差在4.21%～7.90%之间。该结果能够满足日常分析的实验要求，证明了本研究使用的仪器和建立的方法在自来水中亚硝酸钠检测的准确性和实用性。

肉质品中亚硝酸钠的检测

由表2可以看出，实际样品美式培根的亚硝酸钠含量为7.60 mg/kg，双汇培根的亚硝酸钠含量为7.96 mg/kg，均低于国标的要求（0.15 g/kg），平行实验的相对标准偏差分别为8.51%、9.98%。该结果满足日常分析需求，同时，本实验方法相比于离子色谱这种大型精密仪器而言，在精密度和灵敏度不低于离子色谱的基础上，日常维护少、分析速度快、携带便捷，证明该方法在检测实际的肉制品中亚硝酸钠含量时方法的准确性和实用性。

结 论

本研究建立一种基于膜固相萃取-漫反射可见光谱法对水质和肉制品中痕量亚硝酸钠进行定量检测的方法。该方法对国标中使用的衍生化试剂进行优化，并且结合膜富集的技术，具有膜固相萃取的简便、快速、有机试剂使用少、灵敏度高、检出限低、仪器造价成本低等优势，实际样品中的痕量亚硝酸钠含量分析的结果较为准确，精密度也可以接受，研究方法为可见光谱应用于痕量物质的分析提供了可能。

本文《固相萃取光谱法测定水及肉制品中痕量亚硝酸钠》来源于《食品科学》2021年42卷12期309-314页，作者：李超逸，李龙，朱莹，吴婷，杜一平。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191104-043。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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