基于广泛靶向代谢组学的浅黄色和紫色核桃内种皮成分差异分析

核桃（Juglans spp.）是世界四大干果之一，核桃仁是核桃食用部位，其富含蛋白质、脂肪、磷脂、维生素、矿物质等营养成分。核桃又是我国药典收载的中药，是典型的药食同源食品。其药用功效多与富含的多酚和黄酮成分有关，这些物质具有抗氧化、提高免疫力等多方面的功效，是近年研发的热点。核桃仁由胚（种仁或核仁）和内种皮（仁膜）组成，核桃内种皮为包裹在核仁表面的一层薄膜，一般呈浅黄色，也有特异品种、资源呈紫色或鲜红色。许多研究表明核桃仁多酚和黄酮主要集中在内种皮上，抗氧化及抑酶活性显著，适宜进行抗衰老等保健产品的开发。

云南省林业和草原科学院的方贤胜、吴 涛、肖良俊*以普通浅黄色和特异紫色2 种颜色的核桃内种皮为研究材料，利用广泛向代谢组学方法，应用超高效液相色谱-串联质谱技术，检测2 种材料的代谢物种类，并对其差异性进行比较分析，从差异代谢物的角度着手，揭示其多酚、黄酮物质组成及内种皮颜色差异，旨在为核桃内种皮中化学物质表征和功能成分研究提供参考。

1、代谢组成分总体分析

基于迈维（武汉）自建代谢物数据库及相关质谱数据库，对MRM代谢物检测多峰图，通过三重四极杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度，用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，对主要代谢物进行定性和定量分析。在浅黄色和紫色核桃内种皮中，鉴定出23 类680 种代谢物，其中浅黄色核桃内种皮的代谢组成分有23 类670 种，特有的化学物质有7 类12 种；紫色核桃内种皮的代谢组成分有23 类668 种，特有的化学物质有6 类10 种。

2、浅黄色和紫色核桃内种皮代谢组学差异分析

PCA结果

通过对样本进行PCA，判别浅黄色和紫色核桃内种皮各组样本之间的分组之间和组内样本之间的变异度大小。结果得到5 个主成分，其中PC1的贡献率为63.15%，PC2的贡献率为10.84%，且两组样本在二维图上表现出明显的分离趋势（图2），组内之间浅黄色内种皮的分离大于紫色内种皮，在PCA结果上能够从总体上反映出两组样品之间的代谢物差异。

OPLS-DA结果

根据OPLS-DA模型（图3a）对680 种代谢组数据进行分析，浅黄色核桃内种皮样品分布在置信区间的左侧，紫色核桃内种皮样品分布在置信区间的右侧，2 个样品的区分效果丰常明显。OPLS-DA得到PC1的贡献率为62.1%、PC2的贡献率为9.74%，=0.719，=0.999、Q2=0.975，其中Q2＞0.9为出色的模型，相比于PCA模型效果更好。对OPLS-DA进行排列验证（n=200，即进行200 次排列实验）。在模型验证中（图3b），横线对应为原始模型的和Q2，红点和蓝点分别代表Y置换后模型的和Q’2。和Q’2均小于原始模型的和Q2，即相应点都不超过相应的线，则说明模型有意义，可根据VIP值分析筛选其差异代谢物。

差异代谢物鉴定

基于OPLS-DA结果，从获得的多变量分析OPLS-DA模型的VIP值，以其表示对应代谢物的组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度，一般认为VIP≥1的代谢物则为差异显著。初步筛选出两类样品间差异的代谢物，选取VIP≥1的代谢物。浅黄色与紫色核桃内种皮进行筛选共得到的差异代谢物21 类244 种。整体上浅黄色与紫色核桃内种皮差异代谢成分（244 种）占共有代谢成分（658 种）的37.08%，说明不同颜色的核桃内种皮代谢物质差异显著。其中差异较大的是有机酸及衍生物、黄酮、苯丙素、氨基酸及衍生物、黄酮醇5 种类别，分别占比为19.26%、13.11%、9.42%、8.20%和7.38%。

3、差异性代谢产物分析

差异代谢物热图分析

为方便观察代谢物变化规律，对差异显著的代谢物进行归一化处理，并绘制聚类热图，结果如图4所示。该图简单、直观地反映出代谢物的变化情况。在244 种差异代谢成分中，紫色核桃内种皮相对浅黄色核桃内种皮有93 种成分上调，即相对含量增加，增加的代谢成分占244 种差异代谢成分的38.11%，151 种成分下调，即相对含量降低，降低的代谢成分占244 种差异代谢成分的61.89%。

主要差异代谢成分分析

比较浅黄色和紫色核桃内种皮样品中代谢成分定量信息发生的差异倍数变化，将差异倍数进行处理（log 2 FC），变化排在前的20 个差异表达代谢成分如图5所示。与浅黄色核桃内种皮相比，紫色核桃内种皮5 种有机酸及衍生物（3-O-阿魏酰奎宁酸、奎宁酸O-二葡萄糖醛酸、隐绿原酸、新绿原酸、1-咖啡酰奎宁酸），1 种苯丙素（6-羟基-4-甲基香豆素），1 种维生素及衍生物（抗坏血酸），1 种黄酮（木犀草素C-阿魏酰基己糖苷），1 种生物碱（N-甲基色胺），1 种氨基酸及衍生物（Nα-乙酰-L-精氨酸）的相对含量显著增加；2 种原花青素（原花青素B2、原花青素B3），1 种黄酮（氧甲基柚皮素C-戊糖苷），1 种黄酮醇（紫杉叶素），1 种黄酮类（水仙苷），1 种多酚（儿茶素），1 种生物碱（5-甲氧基-N,N-二甲基色胺），1 种有机酸及衍生物（龙胆酸），1 种醇类（去氢催吐萝芙木醇），1 种苯丙素（芥子酰羟基香豆素）的相对含量显著降低。

差异代谢物通路分析

通过KEGG数据库对差异代谢物质进行通路富集分析结果（图6）显示，鉴定出的244 种显著差异代谢物，主要分布在20 条代谢途径中，差异代谢物数量富集最多的前5 条通路：1）次生代谢产物的生物合成通路，主要包括氨基酸及衍生物、核苷酸及衍生物、维生素及衍生物、吲哚及衍生物、有机酸及衍生物等90 种代谢成分；2）黄酮类生物合成通路，主要包括金圣草黄素5-O-己糖苷等48 种代谢成分；3）黄酮和黄酮生物合成通路，主要包括18 种黄酮醇类、7 种黄酮类、8 种黄烷酮、4 种异黄酮等37 种代谢成分；4）不同环境中微生物相关的代谢通路，主要包括30 种代谢成分；5）苯丙烷生物合成通路，主要包括芥子酰羟基香豆素等23 种代谢成分。前5 条通路分别是次生代谢产物生物合成通路、黄酮类生物合成通路、黄酮和黄酮醇生物合成通路、环境微生物相关代谢通路和苯丙烷生物合成通路，分别包括代谢物90 种（36.89%）、48 种（19.67%）、37 种（15.16%）、30 种（12.30%）和23 种（9.43%）。

讨论

本研究采用广泛靶向代谢组学技术，以浅黄色和紫色核桃内种皮为材料，对二者的代谢物进行对比分析。从2 种类型的核桃内种皮中检测到23 类680 种代谢物，其中差异代谢成分（21 类244 种）占共有代谢成分（23 类658 种）的37.08%。

核桃仁略有的苦涩味与其含有的酚类化合物有关，且在内种皮中的含量远高于核仁。虽然酚类化合物没有已知的营养功能，但由于其良好的抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎和抗突变特性，它们对人体健康有重要作用。黄酮类和多酚类物质结构复杂，种类多样，具有镇痛、护肝、抗脑缺血损伤、抗心律失常、抗自由基和抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性和药理作用。

核桃核仁颜色是影响核桃坚果质量分级和销售价格的因素。在GB/T 20398—2006《核桃坚果质量等级》中，核桃坚果分为4 级，特级、I级和II级的核仁颜色都要求黄白，III级为黄白或浅琥珀色。在LY/T 3004—2018《核桃标准综合体》中，核桃坚果分为3 个等级，特级和一级的核仁颜色都要求“黄白或具良种特有颜色”，二级为“黄白、浅琥珀色或具良种特有颜色”。另一方面，由于（紫）红色在中国和其他亚洲国家是一个卖点，因为它象征幸福和好运，因而售价更高。

2 种核桃内种皮相较对方而言，各自特有代谢物质共22 种，占全部代谢物质（680 种）的3.24%。通过文献检索和化学物质数据库检索，22 种特有代谢物质中有相关功能报道的仅1 种苯丙素（花椒毒醇）和3 种生物碱（植保素、茶碱和咖啡碱）。花椒毒醇具有生物活性的线性呋喃香豆素，有强烈的药理学活性，如抗炎、抗氧化，5-羟色胺拮抗和神经保护作用。植保素是一种简单的吲哚生物碱，存在于拟南芥和其他十字花科植物中，其次生代谢产物起植物抗毒素的作用，可以阻止细菌和真菌病原体。茶碱对哮喘和心肺疾病有疗效。咖啡碱可能是世界上最常摄入的药理活性物质。它存在于咖啡、茶、可可等产品以及药物中，适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。本研究对浅黄色和紫色核桃内种皮代谢物进行比较，所检测到的物质可为核桃内种皮的功能研究及下一步开发利用提供参考。

本文《基于广泛靶向代谢组学的浅黄色和紫色核桃内种皮成分差异分析》来源于《食品科学》2021年42卷12期215-221页，作者：方贤胜，吴涛，肖良俊。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191108-099。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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