河南大学国家食用菌中心在Nigella sativa种子活性成分的抗炎和免疫调节作用研究方面取得重要进展

河南大学国家食用菌中心在Nigella sativa种子活性成分的抗炎和免疫调节作用研究方面取得重要进展，该成果在河南省精准营养与保健食品等项目支持下，与新西兰奥克兰大学、埃及国家农业中心合作，以“Nigella sativa: A dietary supplement as an immune-modulator on the basis of bioactive components”为题发表于中科院JCR二区《Frontier in Nutrition》杂志(IF：6.576)。

Nigella sativa种子为毛茛科黑种草属植物N. sativa干燥的种子，原产于西南亚，广泛分布在地中海、中欧、西亚等地。种子入药，广泛用于食品添加剂、防腐剂和香料，也作为食用油在埃及等中东和北非国家被广泛使用；医疗上常用作膳食营养补充剂、祛风剂、利尿剂和驱虫剂等。N. sativa种子具有多种药理作用，包括抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎、降糖、保肝、利尿等。

文献研究表明，营养补充剂和药物的联合使用可能有良好的结果。据报道，N. sativa种子作为营养补充剂对辅助治疗COVID-19有效。此外，以N. sativa种子油作膳食补充剂对T2DM患者表现出良好的心血管保护作用。与其他营养补充剂一样，N. sativa种子也可以通过影响免疫系统来增强身体对疾病的抵抗能力。

研究表明，N. sativa种子在满足营养需求的同时有改善机体免疫系统的作用。黑种草属植物种子化学成分的研究始于20世纪中期，N. sativa种子含有多种生物活性物质，如挥发油、生物碱、甾体、黄酮、皂苷和酚类等。因此，我们选择对N. sativa种子的化学成分进行系统研究，研究其免疫抗炎等功效成分和作用机制，为寻找新的免疫活性成分提供基础。

结果与讨论

化合物结构鉴定

对N. sativa的70%乙醇提取物进行了系统的分离，并鉴定1个新的单萜苷3-methoxythymol-6-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside（1）和11个已知化合物（2-12）。

图1：N. sativa种子化合物结构图

图2：化合物1的1H-1H COSY和HMBC相关

单糖衍生物（化合物5和8）的免疫调节作用

巨噬细胞是机体天然抵抗力的一种重要效应细胞，在先天性和适应性免疫反应中可发挥吞噬、呈递抗原和分泌细胞因子等作用。我们发现，在一定浓度范围内，化合物5和8可以激活巨噬细胞，促进RAW264.7巨噬细胞的吞噬作用，这可能是免疫调节所必需的。

细胞因子是免疫和非免疫细胞释放的细胞间信号蛋白，通过诱导细胞分化和增殖，从而在控制整个生物体内稳态中发挥重要作用。免疫调节剂诱导巨噬细胞合成细胞因子的能力是评估其能否增强先天免疫活性的方法之一。结果表明，化合物5和8能促进RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的释放，最佳剂量为200 mol/L，在此基础上，用qRT-PCR方法测定了化合物5和8 (200 mol/L)对正常培养RAW264.7巨噬细胞中细胞因子mRNA水平的影响。如图3（B）所示，阳性对照组在脂多糖（LPS）作用后，TNF-α和IL-6的基因转录显著升高。此外，与对照组相比，化合物5和8显著增加了TNF-α和IL-6的水平。这表明单糖衍生物可以上调巨噬细胞中TNF-α和IL-6的基因水平，促进IL-6和TNF-α的产生。

为了确定化合物5和8增强RAW264.7巨噬细胞免疫功能的作用机制，我们检测了其对NF-κB信号通路的影响。NF-κB在细胞和机体的免疫、炎症反应、细胞凋亡等过程中起至关重要作用，其通过调控相关炎性因子、趋化因子、生长因子以及环氧合酶-2（COX-2）和一氧化氮合成酶（NOS）诱导酶等表达而参与细胞凋亡、细胞免疫调节、炎症反应、肿瘤发生等多种生物过程。结果显示，与空白组相比，化合物5和8可以促进正常培养的RAW264.7细胞的NF-κB信号通路中关键蛋白p-IκBα和p-p65的表达，从而适度激活NF-κB信号通路并增强免疫力。在正常培养条件下，我们测量了化合物5和8对COX-2和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。如图3(D)所示，LPS可以显著增加iNOS和COX-2 mRNA的表达，同时，化合物5和8（200 μmol/L）能显著上调RAW264.7巨噬细胞中iNOS和COX-2 mRNA的转录水平。此外，与空白组相比，化合物5和8 (50、100和200 μmol/L)显著促进了COX-2和iNOS蛋白的产生。总之，化合物5和8可以在基因和蛋白质水平上显著促进COX-2和iNOS的产生。

图3：化合物5和8对正常培养RAW264.7细胞中NF-κB信号通路的影响

（A）NO的释放量，（B）炎性细胞因子TNF-α、IL-6 mRNA转录水平，（C）TNF-α、IL-6的分泌水平，（D）COX-2和iNOS的mRNA和蛋白表达水平，（E）NF-κB信号通路中关键蛋白的表达水平。GAPDH served as control. Datashown are means ± SEM. ***p <0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.

化合物5和8的抗炎作用

炎症实质就是过度免疫，指在各种强烈的能够破坏机体稳态平衡的刺激下，机体免疫细胞产生大量免疫因子，高活性的免疫因子诱发一系列高代谢反应为主要特征的病理及生理过程，重度的炎症反应甚至可使机体器官衰竭引发死亡。当机体受到病理刺激或损伤刺激时，巨噬细胞会产生大量（超出机体免疫调节范围）生物活性分子，包括一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）以及细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）和IL-6等来防御病原体入侵。炎症过程中NO的增加一般分别归因于iNOS和COX-2的上调。如图4（D）所示，LPS显著刺激iNOS和COX-2 mRNA的转录，而化合物5和8逆转了基因的上调，减少了NO的过度分泌。同时，与RT-PCR结果相一致的是，化合物5和8可以显著降低LPS诱导的巨噬细胞中COX-2和iNOS蛋白的产生。LPS通过与Toll样受体4（TLR4）结合后激活其下游信号通路，促进炎症因子释放，从而扩大炎症反应，吞噬细胞呼吸爆发，生成过量的活性氧，过量的活性氧又会介导细胞中的炎症信号。如图5（F）所示，与空白组相比，LPS组的峰形明显向右移动，表明LPS提高了活性氧的产生，而化合物5和8在200 μmol/L时可以抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中活性氧的过量产生。

NF-κB信号通路是LPS介导的关键细胞信号通路。在细胞静息状态时，细胞质中的NF-κB与其抑制剂IκB结合形成三聚体p50-p65-IκB，处于无活性状态。当受到LPS刺激时，IκB被其激酶IKK催化而发生磷酸化，并在泛素化酶作用下使p50-p65-IκB解体，NF-κB转位到细胞核内发生磷酸化活化，从而介导下游一系列反应。如图4(E)所示，与空白组相比，LPS刺激的RAW264.7细胞p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达显著上调，而化合物5和8可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB通路中关键蛋白p-IκBα和p-NF-κB p65的过度表达，从而抑制NF-κB通路的过度激活并发挥抗炎作用。

图4：化合物5和8对LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB信号通路的影响

（A）细胞存活率；（B）RAW264.7细胞的吞噬活性，；C）NO释放量；，（D）COX-2和iNOS的mRNA和蛋白表达水平，；E）NF-κB通路中关键蛋白的表达水平；（F）活性氧的产生水平。β-Actin servedas a control. Data shown are means ± SEM. ***p < 0.001, **p <0.01, *p < 0.05. ###p < 0.001, ##p < 0.01, #p < 0.05.

图5：化合物5和8对RAW264.7巨噬细胞中NF-κB信号通路影响的潜在机制图

结 论

N. sativa种子中首次分离的单糖衍生物5和8通过调控NF-κB信号通路对免疫和抗炎产生双向调节作用。免疫机制可能与增加正常RAW264.7细胞中细胞因子的释放和mRNA转录水平有关，抗炎可能与抑制LPS刺激下促炎细胞因子的过度释放和mRNA水平的过度转录有关。为进一步研究N. sativa种子作为免疫调节的膳食补充剂提供理论基础。

摘要原文

Nigella sativa: Adietary supplement as an immune-modulator on the basis of bioactive components

Yun Niu1,2‡, Baoguang Wang1,2‡, Li Zhou1,2,3, Changyang Ma1,3, Geoffrey I.N. Waterhouse1,5, Zhenhua Liu1,3*, Adel F. Ahmed3,4*, Dongxiao Sun-Waterhouse1,5*,Wenyi Kang1,2,3*

1National R & D Center for Edible Fungus Processing Technology, Henan University, Kaifeng 475004, China

2Functional Food Engineering Technology Research Center, Henan, Kaifeng, 475004, China

3Joint International Research Laboratory of Food & Medicine Resource Function, Henan Province, Kaifeng 475004, China

4Medicinal and Aromatic Plants Researches Department, Horticulture Research Institute, Agricultural Research Center,Egypt

5School of Chemical Sciences, University of Auckland, Auckland 1142, New Zealand

‡These authors contributed equally to this work.

*Corresponding authors to:

Zhenhua Liu, Email: liuzhenhua623@163.com;

Adel F. Ahmed: Email: adelfahmi_2008@yahoo.com;

Dongxiao Sun-Waterhouse, Email: dxsun72@hotmail.com;

Wenyi Kang, E-mail:kangweny@hotmail.com

Abstract:

Nutrients thatcan be considered as functional foods and exert physiological benefits onimmune system. The seeds of Nigellasativa with many active constituents are mainly used for medicine, foodspice and nutritional supplements in Egypt. Much attention has been paid to N. sativaseeds for their anticancer, antibacterial, anti-inflammatory and immune properties. However, it isunclear that active constituents and mechanisms underlying functions from N.sativa seeds. Thus, the bioactive constituents with immune regulation from N. sativa seeds were systematically studied. A new compound (3-methoxythymol-6-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside1) and elevenknown compounds (2-12) were separated from the N. sativa seeds by chromatographicmethods. Their structures were elucidated by spectroscopic analysis of MS,UV, IR, 1 H- and 13 C-NMR. Furthermore, immunomodulatory effectsof those compounds in RAW 264.7 cells were evaluated by phagocytosis, NO and cytokinerelease, related mRNA transcription and key proteins expression in vitro. Monosaccharide derivatives,Ethyl-α-D-furaarabinose (5) and Ethyl-β-D-fructofuranoside (8),played a bidirectional regulatory role in immunity and anti-inflammationthrough regulating NF-κB signalingpathways. The results showed that active compounds and the mechanism of immune regulationin N. sativa,it indicated that N. sativa seedscould be used as dietary supplements in immunomodulation.

Reference:

Niu Y, Wang B G, Zhou L, et al. Nigella sativa: A dietary supplement as an immune-modulator on the basis ofbioactive components[J]. frontier in Nutrition, 2021. DOI:10.3389/fnut.2021.722813.

作者简介

康文艺 教授

康文艺，博士，教授，河南大学国家食用菌加工技术研发专业中心主任、河南省功能食品工程技术研究中心主任、河南省药食两用资源功能研究国际联合实验室主任、河南省食用菌精深加工产业技术创新战略联盟理事长、全国专业标准化技术委员会委员、中国菌物学会食用菌采后与加工产业分会副会长、中国营养学会营养与保健食品分会常务委员、世界中联中药上市后再评价专业委员会常务理事、国家食品药品监督管理总局特殊食品抽检监测牵头分析专家委员、河南省中药学博士后创新团队副主任、河南省工业技改专家等。目前主要研究方向为药食两用资源的物质基础、其中关键生物活性分子的药效评价及其作用机制，以及原料及其衍生产品的检测方法和质量管理。目前主持“十三五”国家重点研发计划子课题1项，食药总局保健食品专项2项，河南省重大公益专项1项以及省部级项目10余项；发表研究论文400余篇，其中SCI高水平论文超过100篇。基于此工作基础，在2020年获得河南省科技进步奖二等奖和中国商业联合会特等奖。

孙东晓 教授

新西兰皇家科学院属下新西兰食品科技院院士，国际农业和生物系统工程国际委员会“功能食品、健康食品和营养”工作平台主席，中国科技部高端外国专家人才，华南理工大学、山东农业大学和河南大学讲座教授/卓越教授，发表SCI/EI论文100余篇。先后任爱思唯尔国际百科全书领域主编、Food Chemistry高级主编、Food Science and Human Wellness科学主编。

刘振花 副教授

刘振花，博士，硕士生导师。2017/09 - 至今，于河南大学药学院担任副教授。

教育经历 ：

2014/09 - 2017/07，中国科学院昆明植物研究所，博士

2011/09 - 2014/07，中国科学院昆明植物研究所，硕士

2007/09 - 2011/07，河南大学，学士

研究兴趣：

（1）天然产物活性成分研究：以活性为导向的天然产物分离、结构鉴定，涉及“谱效关系-敲出技术-高分辨质谱技术”快速发现复杂中药体系中的活性成分。

（2）药理活性研究：活性成分的抗糖尿病、凝血、抗炎、免疫等活性的研究。

Adel Fahmi Ahmed 研究员

Adel Fahmi Ahmed，研究员，埃及农业研究中心园艺研究所药用与香料植物研究部。

教育背景：

2014年，在中国农业科学院蔬菜花卉研究所无土栽培课题组取得蔬菜与药用植物生物技术专业博士学位，论文题目为：亏缺灌溉对无土栽培辣椒生长、产量、果实品质及辣椒素合成的影响。

2010年，在埃及米尼亚大学农学院园艺系取得农业科学专业理学硕士学位，论文题目为：农业处理对产自艾斯尤特省向日葵生长、开花及葵花籽化学成分的影响。

2001年，在埃及艾斯尤特大学农学院园艺系取得观赏植物与园林造园专业理学学士学位。

参与科研项目：

2008～2009年，尼罗河谷地及三角洲农业生产综合调查课题组成员。

牛云 硕士研究生

牛云，女，2018年9月攻读河南大学中药学专业。在导师的指导下，参与多个科研项目并发表SCI论文8篇，提交国家发明专利4项。获得“河南大学研究生一等奖学金”、“河南大学优秀研究生”、“河南大学优秀研究生奖学金”等荣誉。

王宝光 硕士研究生

王宝光，男，河南濮阳人，2019年9月进入河南大学攻读药学专业。在导师的指导下，参与多个科研项目并发表SCI论文4篇。获得“研究生学业一等奖学金”、“河南大学优秀研究生”、“河南大学优秀研究生奖学金”等荣誉。

编辑/责编：张睿梅。

文章来源于河南大学国家食用菌中心。点击下方阅读原文即可查看原文。

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