上交《Science Advances》：梯度双金属离子基水凝胶用于肌腱-骨嵌入的组织微结构重建

【科研摘要】

金属离子在人体的正常过程中扮演着重要的角色，包括维持生命功能、调节新陈代谢和促进组织修复。 许多金属离子，如Cu 2+ 、Ca 2+ 和Ag + ，可以通过平衡成骨细胞和破骨细胞的功能来促进骨再生。锌离子可以通过促进细胞外基质(ECM)的合成和分泌来修复受损的皮肤。在 不同的组织中，这些金属离子的含量是不同的，不同的生物活性离子对组织再生具有联合或协同作用。 不同组织对金属离子的选择性尤为重要。

目前，在复杂损伤的组织中，实现不同金属离子在不同组织中的选择性吸收以促进损伤组织的同步重建和再生是极具挑战性的。梯度在引导多种组织的功能方面起着至关重要的作用。因此，基于各种金属离子在组织再生方面的优势，设计一种基于金属离子的新型生物材料有望调节不同梯度组织的过度生长。

上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海市伤骨科研究所邓廉夫、王蕾、崔文国作为通讯作者在《Science Advances》上发表以<梯度双金属离子基水凝胶用于肌腱-骨嵌入的组织微结构重建>为题的论文。

该团队 首次通过巯基与铜、锌离子的一步配位交联，构建了一种梯度双金属(铜、锌)离子水凝胶，用于肌腱-骨植入的微观结构重建。 在该双金属水凝胶体系中，锌离子和铜离子不仅能起到交联剂的作用，而且具有很强的抗菌作用和体外诱导再生能力。在大鼠肩袖撕裂模型中，进一步验证了水凝胶同时促进肌腱生成和成骨的能力。研究发现，Cu/Zn梯度层可诱导肌腱-骨界面胶原蛋白和纤维软骨大量排列和生长。总体而言，梯度双金属离子水凝胶确保了可获得性，并提供了再生具有生理复杂性或界面组织的不均匀组织的机会。

【主图导读】

图1.梯度双金属离子基水凝胶的原理、制备及工作原理图。(A)新型梯度双金属水凝胶的原理、制备及梯度结构的展示。(B)原位植入新型RCT水凝胶。(C)肌腱-骨植入同步再生梯度水凝胶的作用机制。

图2。水凝胶的形态和表征。(A)梯度双金属水凝胶的凝胶化过程。(B)制备s-Cu-明胶、s -Zn-明胶和s-明胶基团的化学方程式。(C至E)不同基团的500-m微球的典型扫描电镜图像。(F)从横截面记录的元素分布的能谱测绘。(G)沿垂直方向的铜和锌含量的量化(n=3)，其中x轴表示从顶部到底部与五个平均小截面的距离。(H至J)应变扫描测量s-Cu-明胶、s-Zn-明胶和s-明胶基团。(K至L)s-Cu-明胶和s-Zn-明胶组的扫频测量。(M)s-Cu-明胶和s-Zn-明胶组的动态阶跃应变测量。

图3 。 梯度双金属水凝胶的细胞相容性和抗菌性能。(A)典型的荧光图像显示，在s-Cu-明胶和s-Zn-明胶中培养1、3和5天后，活的钙黄绿素染色(绿色)和死亡的碘化丙啶标记的rMSCs。(B)CCK8法检测培养1、 4、7d后细胞增殖情况(n=3)；10 0m.(B)CCK8比色法测定细胞增殖情况(n=3)。(C和D)根据琼脂扩散试验结果(n=3)测定两种凝胶对金黄色葡萄球菌的抗菌敏感性。刻度尺，1厘米。(E)在新型水凝胶中培养1、3和5天后，对成骨细胞和腱细胞进行活/死染色。(F)CCK8法检测培养1、4、7d后的成骨细胞增殖情况(n=3)。(G)CCK8检测显示肌腱细胞在培养1、4、7d后增殖(n=3)(P<0.05)。OD450，光密度为450 nm。

图4.细胞行为的体外分析。(A)在双金属离子基水凝胶中培养3天后，用鬼臼毒素对肌动蛋白细丝(红色)和细胞核(蓝色)对成骨细胞和腱细胞进行双染色的荧光图像。(二)细胞骨架的 详情。(C)细胞在不同水凝胶表面的分布。比例尺，100μm.(d和E)双金属水凝胶上成骨细胞和肌腱细胞分布的定量(n=3)(P<0.0 5)。

图5 。 对细胞行为影响的体外分析。(A)第1、3、7、14天碱性磷酸酶染色，显示有代表性的图像。比例尺，2毫米。(B)显示ALP活性的汇总数据(n=3)。(C)在第1、7、14、21天用碱性磷酸酶(茜素红)染色矿化基质，显示有代表性的图像。比例尺，2毫米。(D)通过量化染色矿化基质的茜素红S的量来汇总显示钙产生的数据(n=3)。(E-H)培养7d后Runx2、coli、碱性磷酸酶(ALP)和培养14d后OCN等成骨相关基因的表达。(1)CCK8法检测肌腱细胞培养3d后增殖情况(n=3)。(J)锌离子刺激的腱细胞中Coli、ColIII、MMP13、SCX和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白的表达水平。(K-M)锌离子刺激肌腱细胞肌腱相关基因的表达(n=3)(*P<0.001，**P<0.01，*P<0.05)。比例尺，2 mm。

图6。新型水凝胶的体内恢复能力。(A)植入8周后，拍摄具有代表性的图像和MRI扫描图像，以橙色突出显示新肌腱。比例尺(普通照片)，2 mm；比例尺(细节照片)，1 mm。(B)连续8周观察各组的显微CT图像。(C和D)修复的肩袖组织的最大载荷和刚度。(E、F)各组(n=3)的骨体积密度(BVD)和骨体积分数(BV/YV)(*P<0.05，**p<0.01)。

图7 。 治疗后新形成的肌腱-骨界面组织的形态学分析。(A)用纯缝合(缝合)、硫化明胶水凝胶(s-明胶)和双金属离子水凝胶(s-Cu/Zn-明胶)处理的小鼠苏木精-伊红(H&E)染色切片的代表性图像。T，肌腱；I，界面；B，骨。(B)不同治疗组(n=3)肌腱成熟评分。(C)经治疗的小鼠甲苯胺蓝染色的代表性图像。(D)不同处理组(n=3)新生纤维软骨面积(P<0.05)。比例尺，100µm。

【结论】

纤维软骨再生一直是肌腱-骨界面修复学领域的研究热点。综上所述，该研究基于金属离子配位和交联硫代化明胶的原理，制备了一种新型的梯度双金属(Zn 2+ 和Cu 2+ )水凝胶。结果表明， 这种新型水凝胶体系极大地改进了急性全层冈上肌腱断裂的修复方法。除具有组织修复功能外，还具有缓释和抗菌作用。这种新颖的材料结构具有重要的作用： 1)肌腱-骨界面是人体最重要的承重部位。它是肌腱组织和骨组织之间的过渡结构，并在这两个组织之间传导机械作用。2)模拟了植入部位的组织学特征，认为Cu 2+ 、Zn 2+ 与巯基交联形成稳定的螯合物，包括Zn 2+ 层、Zn 2+ /Cu 2+ 界面层和Cu 2+ 层。 基于不同空间水平的生物效应，这三种不同的金属离子层可以实现肌腱-骨界面上不同组织的同步愈合。最后释放的金属离子可能会被局部组织吸收和代谢。

通过体外应用，这种新型水凝胶诱导了良好的成骨分化和肌腱相关蛋白的表达。此外，还证实了这种含有双金属层的材料可以通过同时诱导骨和肌腱修复来促进纤维软骨穿透，并有效地修复急性全层冈上肌腱断裂。总体而言，梯度微结构在指导包括肌腱、软骨等在内的多种组织的功能方面起着至关重要的作用。

在该研究中，金属离子具有组织修复能力和金属离子在水凝胶空间结构中的梯度排列，有助于复杂组织的修复。组织修复是可能的，原因如下：

1)Cu 2+ 可以诱导骨软骨界面的整体修复，而Zn 2+ 在维持软骨分化方面起着重要作用。因此，在这两种离子的共同作用下，可以促进软骨再生，维持过渡层区域的软骨状态。

2)纤维软骨与透明软骨的区别在于纤维软骨中含有大量的纤维蛋白。实验结果表明，Cu~(2+)和Zn~(2+)均能促进相应细胞中大肠杆菌的表达，有利于纤维软骨部分胶原的排列，促进纤维软骨的早期形成。

3)肌腱-骨界面上存在矿化纤维软骨和非矿化纤维软骨两种类型。根据实验结果，铜水凝胶具有促进成骨分化的能力，锌水凝胶具有促进肌腱分化的能力。而且，在Cu/Zn离子梯度结构区域，随着Cu 2+ 浓度的逐渐增加，靠近Cu 2+ 高浓度层的细胞将逐渐矿化并演化成矿化的纤维软骨，而随着Zn 2+ 浓度的逐渐增加，相关区域的细胞将维持纤维软骨的外观。金属离子的梯度排列也是纤维软骨形成的重要原因。

4)早期力学性能的恢复也能更好地促进纤维软骨的再生。

因此，这些梯度双金属离子基水凝胶有望成为一种很有前途的仿生生物材料，并为促进梯度微结构愈合提供一种新的治疗方法。

参考文献：https://doi.org/10.1126/sciadv.abg3816

文章来源高分子凝胶新进展

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