产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用

β-甘露聚糖酶是一种能够特异性水解甘露聚糖主链中β-1,4-糖苷键的水解酶，产物主要为不同聚合度的甘露寡糖。β-甘露聚糖酶在细菌、放线菌、真菌、植物和一些低等动物中广泛存在，微生物来源的β-甘露聚糖酶产量高、成本低、提取简单，因而最具应用潜力。

产黄青霉（Penicillium chrysogenum）是一种重要的工业用真菌，主要用于生产青霉素和多种有机酸，同时能够分泌木聚糖酶、淀粉酶等多种糖苷水解酶。中国农业大学食品科学与营养工程学院的甄红敏和中国农业大学工学院的李延啸*、闫巧娟*等人从产黄青霉基因组中发掘出一个假想蛋白（GenBank No.CAP97963.1），预测为GH26家族β-甘露聚糖酶（PcMan26A），将其基因导入毕赤酵母GS115中高效表达，研究该酶酶学性质，并用于水解魔芋粉制备魔芋甘露寡糖，旨在为利用魔芋粉制备魔芋甘露寡糖提供更多选择。

1、PcMan26A的基因克隆

氨基酸序列同源比对分析表明（图1），该酶与黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶（GenBank No.A2R6F5.1）相似性最高，为67.8%；其次分别为Thermothelomyces thermophilus ATCC 42464（GenBank No.G2Q4H7.1）、构巢曲霉（A. nidulans）FGSC A4（GenBank No.Q5AWB7.1）、海洋红嗜热盐菌（Rhodothermus marinus）DSM 4252（GenBank No.P49425.3）和Piromyces sp.（GenBank No.P55296.1）来源的β-甘露聚糖酶，其相似性分别为43.2%、41.8%、40.5%和31.0%。通过氨基酸序列比对预测，该酶中第189位和281位的谷氨酸残基（Glu189和Glu281）分别为该酶亲核试剂和广义酸碱。

2、PcMan26A的高效表达及纯化

通过高拷贝转化子筛选，1 株高产重组菌株的摇瓶发酵酶活力为261.8 U/mL。将该重组菌株进行高密度发酵，168 h后菌体湿质量达500 g/L，酶活力和蛋白质量浓度分别达到25 200 U/mL和10.1 mg/mL（图2A）。甲醇诱导开始后，发酵液中首先出现分子质量60 kDa的蛋白条带，发酵48 h后出现47 kDa的蛋白条带；随着诱导时间延长，2 条蛋白条带均逐渐变粗（图2B）。

通过阴离子交换层析一步纯化得到电泳级纯酶（PcMan26A），回收率为80.7%，纯化倍数为1.2 倍。PcMan26A在电泳胶上呈2 条不同的条带，其分子质量分别为60 kDa和47 kDa，均有明显拖尾现象；酶谱分析表明，2 条蛋白均有β-甘露聚糖酶活性（图3），这表明该酶在毕赤酵母中表达可能发生了不同程度的糖基化。去糖基化酶Endo H处理后，PcMan26A在电泳胶上仍然呈2 条带，但分子质量分别降低至50 kDa和39 kDa，没有出现拖尾现象，表明毕赤酵母表达的PcMan26A确实发生了糖基化。

3、PcMan26A的酶学性质

如图4所示，该酶的最适pH值为6.0，pH 4.0～8.0处理30 min仍保留80%以上的酶活力；该酶的最适温度为50 ℃，在45 ℃下处理30 min仍保留90%以上的酶活力。

4、PcMan26A的底物特异性和水解特性

水解特性分析表明（图5），该酶水解槐豆胶时主要产生甘露二糖、甘露三糖和一些聚合度大于3的甘露寡糖；水解魔芋粉时主要产生聚合度大于4的甘露寡糖；水解瓜尔胶时主要产生聚合度大于5的甘露寡糖。此外，该酶的最小水解底物为甘露五糖，主要产生甘露四糖和少量的甘露糖。

5、魔芋甘露聚糖的制备

利用PcMan26A在最适条件下（200 g/L魔芋粉，加酶量200 U/mL）水解魔芋粉12 h后，魔芋粉中葡甘露聚糖的水解率为91.8%，魔芋甘露寡糖总得率为86.2%。经HPLC分析，产物主要为聚合度大于4的甘露寡糖（图6）。此外，甘露六糖保留时间右侧寡糖组分的峰面积超过总峰面积的50%，符合我国颁布的“新食品原料”（2013年第10号公告）目录中的相关规定。

结 论

本研究将一个来源于产黄青霉GH26家族的PcMan26A在毕赤酵母中高效表达，经高密度发酵产酶水平达25 200 U/mL。该酶对魔芋粉具有最高的比活力，水解甘露聚糖主要产生一些高聚合度（＞4）甘露寡糖，在甘露寡糖酶法制备中具有应用潜力。利用PcMan26A水解魔芋粉成功制备得到魔芋甘露寡糖。这为魔芋甘露寡糖的酶法制备提供了更多选择。

本文《产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用》来源于《食品科学》2021年42卷8期98-105页，作者：甄红敏，华晓晗，马俊文，温永平，李延啸，闫巧娟，江正强。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200819-248。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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