小干扰RNA(siRNA)通过选择性沉默与疾病相关的异常基因，特别是“不可用药”的基因，已经成为从遗传疾病、免疫缺陷感染到癌症的一种很有前景的疾病治疗范式。尽管siRNA在临床应用方面取得了突破性进展，但溶酶体捕获导致的非病毒载体(包括脂质纳米颗粒(LNPs)和聚合物纳米颗粒(NPs))的低siRNA传递效率仍然极大地阻碍了基于siRNA的治疗方法的发展。定量分析表明，通过网格蛋白介导的内吞(CME)和巨胞吞(macropinocytosis)进入细胞后，≅70%内化的基于LNPs载体的siRNA具有胞吐作用，只有一小部分(1-2%)能从内溶酶体逃逸到胞浆中。与LNPs类似，由聚合物NPs递送的siRNA在内化后也被困在溶酶体中。
为避免siRNA的溶酶体捕获，长期以来研究者们一直致力于开发智能聚合NPs以逃避溶酶体，然而，少有研究关注改变聚合NPs的胞内运输途径以绕过溶酶体，从而提高siRNA递送效率。通常，聚合NPs利用不同的内吞途径进入细胞，并被运输到不同的细胞内目的地。通过完善的CME内化后，聚合NPs最终被转运到溶酶体中。然而，通过诱导小窝介导的内吞作用(CvME)进入细胞的高分子NPs的胞内运输尚不清楚，且存在争议，可能与细胞类型和NPs的组成有关。一些研究已经证明内化的小窝内陷包埋了与溶酶体融合的聚合NPs，而其他研究报道他们采用了特定的运输路线绕过溶酶体。此外，核内体-高尔基ER的行程对某些病毒运输是有效的，这可能也适用于siRNA传递系统。如果是后一种情况，CvME途径似乎是有效的细胞质递送siRNA。为了实质性地证实这一观点，需要澄清以下问题:除了溶酶体，应该选择哪些亚细胞细胞器作为载siRNA聚合NPs的目的地? siRNA是如何运输到预定的细胞器的，其中有多少将被排出细胞外? NPs一旦通过多种内吞途径内化，CvME与其他内吞途径之间的关系是什么? 哪些关键的信号因子参与了调控与CvME相关的细胞内处理，以及它们如何影响siRNA的体内外传递效率? 回答这些问题将为进一步改进基于纳米载体的siRNA递送提供重要线索。
为解决上述问题，复旦大学印春华课题组制备了甘露糖修饰的三甲基壳聚糖半胱氨酸/三聚磷酸基载有siRNA的NPs(MTC/TPP NPs)，然后将其作为模型来充分研究其细胞内的处理过程，并揭示其siRNA传递效率的决定因素，如图1所示。该课题组之前的研究表明MTC/TPP中存在siRNA传递NPs通过CvME和巨噬细胞吞噬作用被内化到巨噬细胞中，这可能与它们对急性肝损伤和溃疡性结肠炎的有效治疗密切相关。在小鼠和其他啮齿动物中，MTC/TPP NPs的治疗效力可在极低的siRNA剂量(30和50 μg kg−1)下实现。
Scheme 1. MTC/TPP NPs 的(a)制备和(b)表征 (动态光散射和透射电镜检测)。
作者采用多重成像和分子生物学技术来鉴定参与MTC/TPPNPs中siRNA的巨噬细胞摄取和胞内处理的关键分子和细胞器。研究表明，高尔基复合物和内质网是siRNA高效传递到巨噬细胞所需的关键细胞器，其中siRNA的积累与其沉默效率呈正相关(r = 0.94)。实验结果还确定了syntaxin6和Niemann−Pick类型C1 (NPC1)是MTC/TPP NPs介导siRNA进入巨噬细胞的体内/外不可或缺的调控因子。Syntaxin6和NPC1敲除显著减少了MTC/TPP NPs中传递的siRNA的在巨噬细胞中的细胞摄取和基因沉默，导致小鼠急性肝损伤治疗效果不佳。以上研究结果有力地证实了这一点，CvME是一种聚合物NPs基siRNA在体外和体内传递到巨噬细胞的有效的途径。
Figure 1．含TNF-α/Scr siRNA的MTC/TPP NPs治疗急性肝损伤。
结论:我们利用MTC/TPP NPs深入研究了参与CvME通路的精确分子机制，并确定了影响siRNA介导的体外和体内传递效率的潜在蛋白。CvME依赖的高尔基复合物/内质网聚集有助于提高基因沉默效率。我们的结论是CvME路线是一个高效的途径用于siRNA的细胞质递送。从治疗的角度来看，依赖于CvME通路的基于聚合物的NPs可能会降低siRNA药物在溶酶体存储病和帕金森病的递送效果。未来，为了进一步探索病理条件导致的蛋白表达异常对NPs基因传递效率的影响，还需要揭示更多参与纳米载体胞内加工的关键角色，这无疑将为siRNA药物临床使用的有效性提供指导。此外，siRNA到巨噬细胞的有效递送将为巨噬细胞相关疾病的治疗提供另一种选择，包括动脉粥样硬化、1型糖尿病、病毒感染和癌症。
全文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.0c08596
来源：高分子科学前沿
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