Plant Cell | 东北农业大学孟凡立教授等揭示植物内含子型增强子精确调控基因时空特异性表达的分子机制

责编 | 奕梵

“内含子型增强子在植物中的功能”

增强子是调控基因表达重要顺式作用元件之一，可以增强目标基因的转录效率。增强子位于目标基因上游或者下游，也可以位于基因内含子中。真核生物基因在转录过程中将内含子移除或“剪接掉”，将外显子连接在一起，形成成熟mRNA，因此内含子一直被认为是垃圾序列或“自私DNA”。自从1983年小鼠免疫球蛋白重链基因中发现内含子具有增强子功能以来，越来越多研究证明位于内含子中的增强子在哺乳动物的基因表达调控中起着重要作用。相比之下，内含子型增强子在植物中的功能在很大程度上还未被探索。

2021年3月25日，东北农业大学农学院孟凡立教授课题组在The Plant Cell在线发表了题为Genomic Editing of Intronic Enhancers Unveils Their Role in Fine-Tuning Tissue-Specific Gene Expression in Arabidopsis thaliana的研究论文。该研究在全基因组范围内鉴定拟南芥幼苗和花组织中的内含子型增强子，并深入揭示了内含子型增强子精确调控同源基因组织和发育特异性表达的分子机制。The Plant Cell同期在In Brief 栏目发表了题为“Not-so-selfish-DNA? Intronic enhancers fine-tune spatio-temporal gene expression”的评论文章，对该工作进行了推介。

DNase I 超敏感位点（DNase I-hypersensitive sites, DHS）是鉴定顺式作用元件的金标准。该研究基于蒋继明教授实验室DNase-Seq获得的DHSs数据，进行全基因组范围内含子型增强子预测，在幼苗中鉴定出与806个基因相关的941个候选内含子型增强子，在花中鉴定出与1069个基因相关的1271个内含子型增强子（图1）。通过获得稳定转基因拟南芥来检测报告基因GUS的表达信号，21个内含子型DHSs中15个（71%）被证实具有增强子功能。

图1 拟南芥内含子型DHSs分布特征。（a）拟南芥幼苗和花中预测的内含子型候选增强子。（b）位于AGL11基因内含子型中的DHSs 。

DHS7位于TRIPTYCHON（TRY）基因的第二个内含子中，TRY基因编码MYB转录因子正调控根毛形成负调控叶苗形成，并参与调控拟南芥开花过程。高分辨率拟南芥MHS-seq显示，DHS7是由DHS7#1和DHS7#2组成复合型增强子，DHS7#1只在花中激活GUS表达，而DHS7#1在叶片和根中激活GUS表达。

利用CRISPR/Cas9编辑技术对DHS7#1和DHS7#2增强子进行单个和2个联合敲除。敲除增强子DHS7#1（69~81bp）导致21d叶片中TRY表达降低, 敲除株系表现晚花；敲除增强子DHS7#2（56~68bp）导致14d叶片中TRY表达降低, 敲除株系莲座叶的叶毛分支增加和成簇生长；而DHS7#1和DHS7#2双敲株系（166~187bp）既表现晚花又表现叶毛分支增加和成簇生长（图2）。

图2 DHS7 CRISPR/Cas9株系和TRY突变体的表型分析。（A）开花时期表型。（B-C）叶毛表型。

酵母单杂交进一步发现，增强子DHS7#1结合转录因子SPL9，在老叶中增强TRY基因表达，以提高FT基因表达，从而促进开花；而增强子DHS7#2结合EDT1转录因子在新生叶中增强TRY基因表达，来控制叶毛形态发育。

采用相同技术敲除CSLA10基因第7个内含子中的DHS44增强子，导致花器官脱落离区中CSLA10表达量降低55%，延迟了拟南芥突变体花器官脱落（图3）。内含子型增强子敲除后，同源基因的表达并没有完全消除且mRNA正常剪接，仅在拟南芥特异发育阶段或特异组织抑制同源基因表达，并对植物的形态和发育产生明显的表型效应。

综上所述，植物内含子型增强子精确控制组织特异性基因的时空表达，在目标基因表达中扮演着“调节器”的作用。

图3 DHS44增强子的功能分析。（A）DHS44在CSLA10基因中的IGV示意图。（B）DHS44仅在老花花器官脱落离区激活GUS表达。（C-G）野生型、DHS44 CRISPR/Cas9株系和CSLA10突变体花器官脱落区表型。（H）CSLA10在不同组织中的表达量。（I）CSLA10在野生型、DHS44 CRISPR/Cas9株系和CSLA10突变体中花器官脱落区上部组织中的表达量。（J）CSLA10在野生型、DHS44 CRISPR/Cas9株系和CSLA10突变体中花器官脱落区中的表达量。（K）CSLA10在野生型、DHS44 CRISPR/Cas9株系和CSLA10突变体中花器官脱落区下部组织中的表达量。

东北农业大学孟凡立教授和美国密歇根州立大学赵海南博士为该论文共同第一作者，美国密歇根州立大学蒋继明教授为通讯作者，东北农业大学博士生杨明宇和硕士生李洋参与了此项工作。该工作得到了国家重点研究发展规划、黑龙江省自然基金和东北农业大学ESI学科提升计划的资助。

https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koab095/6189055

https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koab093/6187954