AD是老年人最常见的神经退行性疾病，其病理特征为神经炎性斑块和神经原纤维缠结。神经原纤维缠结的主要蛋白质复合物是过度磷酸化的tau蛋白，而在神经炎症斑块中Aβ是主要的蛋白质复合物。
AD中的大部分Aβ是N末端截短或修饰的Aβ变体，这类Aβ更具疏水性和淀粉样变性，但是关于其是如何产生的、以及涉及到哪些细胞类型或蛋白水解酶等问题，目前尚不清楚。反应性星形胶质细胞和小胶质细胞被认为是这些Aβ变体潜在的来源之一，已有的研究报道了星形胶质细胞和小胶质细胞在AD中可分泌比神经元更高比例的末端修饰或截断的Aβ变体。
另一方面，组织蛋白酶B（CatB）被分析表明发挥β分泌酶活性，可促进Aβ的产生；但它似乎又通过C端截短来降解Aβ，这使得其在Aβ代谢中的作用变得十分不清楚。在AD患者脑组织和血浆样本中均已检测到CatB水平升高。因此，为了研究CatB对Aβ产生的具体作用，来自德国的研究人员在鸡和人的原代星形胶质细胞上研究探讨了CatB的确切生物学作用。
1. 细胞过氧化半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d和CA-074Me可降低Aβ2-40的含量
免疫印迹结果检测细胞培养上清液中的Aβ2-x含量，结果显示，在用E64d和CA-074Me处理鸡星形胶质细胞后，Aβ2-x含量均降低为对照组的50%以下。相反地，E64d并不能降低Aβ1-x的含量；而在高浓度的CA-074Me处理后，结果显示，Aβ1-37、Aβ1-38和Aβ1-39的含量略有降低，但Aβ1-40和Aβ1-42含量无明显变化。
有趣的是，CA-074Me治疗显著降低了单个特异的Aβ变体（标记为Aβ1-x），而Aβ1-x的确切长度和化学结构仍未确定，进一步研究发现Aβ1-x与其他Aβ1蛋白的等电点位移有很大不同。因此总的来说，两类细胞蛋白酶抑制剂处理降低了原代星形胶质细胞培养上清液中Aβ2-x的相对含量。
图1：Aβ2-x相对量的变化
2. 培养的鸡星形胶质细胞中成熟CatB蛋白水平和CatB活性高于神经元
由于CA-074Me似乎主要影响星形胶质细胞分泌的Aβ2-x，因此研究人员继续比较了培养的星形胶质细胞和神经元中CatB蛋白的相对丰度及其酶活性。Western blot结果显示，星形胶质细胞中成熟CatB的表达和细胞裂解产物中的CatB活性是神经元的4倍以上。另外与神经元相比，星形胶质细胞主要表达更长的APP亚型，因此将继续选择APP751亚型进行细胞系的转染。
3. 在H4 APP751神经胶质瘤细胞中，CRISPR/Cas9对CTSB的敲除和CA-074Me对CatB的抑制作用增加了Aβ总量的分泌
研究人员首先建立了H4 APP751细胞系方便后续检测Aβ含量。在使用CA-074Me处理后检测发现，Aβ2-x浓度降低，但细胞总蛋白水平略有升高，同时细胞裂解产物中的CatB水平保持不变。另一方面，当使用CRISPR技术敲除CTSB后发现细胞培养上清液中Aβ2-x的丰度略有降低。总体而言，CA-074Me和CatB基因敲除药物抑制CatB后的观察表明，CatB可能参与了神经胶质瘤细胞中Aβ的降解，但对原代星形胶质细胞没有明显影响。
图2：在H4 APP751神经胶质瘤细胞中，CRISPR/Cas9对CTSB的敲除和CA-074Me对CatB的抑制作用增加了Aβ总量的分泌
4. 细胞特异性CatB抑制剂CA-074和ATP酶抑制剂Baf-A1对Aβ1-x分泌的抑制作用
由于CatB的抑制作用对于原代星形胶质细胞或H4细胞的不同影响可能是由于活性CatB定位不同导致的，所以研究人员用不渗透CA-074处理细胞进行接下来的探究。结果显示，CA-074降低了Aβ2-40的量，其程度与CA-074Me相似。而Baf-A1处理导致Aβ1-x显著降低，而Aβ2-40的量增加。
图3：细胞特异性CatB抑制剂CA-074和ATP酶抑制剂Baf-A1对Aβ1-x分泌的抑制作用
5. CA-074Me的治疗改变了人星形胶质细胞和H4细胞的溶酶体形态
染色后24小时结果表明，CA-074Me处理后检测的颗粒平均荧光强度和尺寸的增加。
6. 总结
溶酶体CatB似乎与神经胶质瘤细胞培养基中Aβ1-x的降解有关，但与原代星形胶质细胞无关；然而，星形胶质细胞中N末端截短的Aβ2-x的产生似乎是由血浆膜相关的CatB介导的。
图4：总结
编译作者：十级胖胖 (Brainnews创作团队)
校审： Simon (Brainnews编辑部)
参考文献：
Oberstein TJ, Utz J, Spitzer P , Klafki HW, Wiltfang J, Lewczuk P , Kornhuber J and Maler JM (2021) The Role of Cathepsin B in the Degradation of Aβ and in the Production of Aβ Peptides Starting With Ala2 in Cultured Astrocytes. Front. Mol. Neurosci. 13:615740. doi: 10.3389/fnmol.2020.615740
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