瑞典皇家理工学院《Adv. Funct. Mater》用交联结构调节粘蛋白水凝胶的生物活性

【科研摘要】

可以将再生医学技术中使用的 由交联大分子制成的水凝胶设计为以定义的方式影响周围细胞和组织的命运。 它们的功能通常取决于生物活性部分的类型和数量，例如水凝胶中存在的受体配体。但是，如何将这些部分呈递给细胞的细节也可能是有用的。最近， 瑞典皇家理工学院 Kun Jiang 和 Thomas Crouzier 教授团队 探索了水凝胶的交联结构如何影响其生物活性。结果表明，牛上颌下黏蛋白是高度糖基化和免疫调节的蛋白质，无论它们是通过其聚糖还是通过其蛋白质结构域交联，都表现出截然不同的生物活性。相关成果以题为 Modulating the Bioactivity of Mucin Hydrogels with Crosslinking Architecture 发表在《A dvanced Functional Materials 》上。酶降解的敏感性和巨噬细胞反应都受到影响，而流变性质和扩散障碍几乎不受影响。 结果表明交联结构影响底物对蛋白酶的可及性以及暴露于巨噬细胞的唾液酸残基的模式。 因此，通过选择交联策略来调节结合位点的可及性似乎是调节基于水凝胶的系统生物活性的有用参数。

【图文解析】

作者研究了改变粘蛋白上交联的位置是否会影响所得水凝胶的材料特性和生物活性。粘蛋白可以描述为洗瓶刷结构（图 1）。交联可以放在蛋白质“核心”上，也可以放在寡糖“刷子”上。使用四嗪（Tz）和降冰片烯（Nb）修饰的牛颌下粘蛋白，它们在混合时会自发形成稳定的水凝胶。使用EDC/NHS偶联剂将黏蛋白核心上的交联键定位（蛋白质-蛋白质交联或Prot-Prot），并与使用高碘酸氧化介导形成的基于刷子的交联（聚糖-聚糖交联或Glyn-Glyn）进行比较。醛对粘蛋白糖的影响（图1）。通过比较Prot-Prot与Glyn-Glyn交联，发现交联定位对所得凝胶的流变性和阻隔性能有轻微影响，但强烈影响其对蛋白酶降解的敏感性和生物活性，这是巨噬细胞反应所暗示的到凝胶。

图 1在蛋白质主链或聚糖链上用四嗪和降冰片烯修饰粘蛋白的图示。 蛋白质骨架（Prot-Prot）和聚糖侧链（Glyn-Glyn）交联的粘蛋白凝胶在巨噬细胞和酶处理方面具有不同的性能。

2.1黏蛋白可以通过其聚糖交联，同时保留大部分唾液酸残基

因此，作者首先通过改变反应时间和高碘酸钠的浓度来优化粘蛋白的氧化。 发现所有高碘酸盐浓度的氧化在60分钟内达到平衡。高碘酸盐浓度从1 mm增加到10 mm，在60分钟时消耗的高碘酸盐量（图2A）以及因此产生的醛量（图2B）增加。通过高效阴离子交换色谱法（HPAEC）对氧化后的粘蛋白Neu5Ac和Neu5Gc的唾液酸含量进行了测试。用1和2 mm高碘酸钠氧化30分钟后，Neu5Ac的量分别减少了约31％和48％。高碘酸钠浓度在5和10 mm时，Neu5Ac的含量进一步降低（图2C）。 在醛与 Tz和Nb衍生物的胺基反应之后，通过NMR分析透析的产物。如图2D所示，Tz的峰在7.15至7.7 ppm处，Nb的峰在5.8至6.2 ppm处，证实了它们与粘蛋白的成功结合。

图2 A）在60分钟内使用不同浓度的NaIO4消耗的NaIO4量，B）氧化后每毫克BSM产生的醛基数量，假设消耗一种NaIO4会导致一个醛基，C）剩余的唾液酸 氧化后每毫克BSM的Neu5Ac和Neu5Gc的酸含量以及BSM和功能化BSM的D）NMR光谱。统计显着性通过Prism 8.0通过单因素方差分析进行计算。

2.2交联局部化影响胶凝动力学

然后，作者研究了水凝胶的机械性能，这是影响生物材料性能几个方面的关键特性，包括它们与细胞的相互作用 .Prot-Prot凝胶（图3A）对于Glyn-Glyn凝胶（图3B），从测量开始，储能模量就超过了损耗模量，表明混合后凝胶已经开始形成。

图 3 蛋白-蛋白质和聚糖-聚糖粘蛋白凝胶的流变学表征。

如图 3C所示，可以通过两次交联形成自立的粘蛋白水凝胶。假设相似的Tz和Nb量接枝到粘蛋白上，并且交联反应导致相同数量的剩余Nb（图3D）， 作者 得出结论，两种凝胶的交联度相似。

2.3交联定位不会影响凝胶对右旋糖酐的渗透性

聚合物网络的交联会改变水凝胶的局部结构，进而影响其与其他分子的相互作用。 测试了具有不同摩尔质量和不同流体动力学直径（DH）的FITC标记葡聚糖（F-dextran）在凝胶中的扩散（图4），并计算了它们的扩散系数。

图4 FITC标记的4、10和70 kDa葡聚糖向A）Prot-Prot凝胶和B）Glyn-Glyn凝胶的扩散。

2.4交联的本地化影响凝胶对蛋白酶的敏感性

绘制凝胶的剩余荧光强度随时间变化的曲线（图 5A，D）。当暴露于胰蛋白酶时，Prot-Prot凝胶需要10小时才能完全降解。凝胶首先缓慢降解，在最初的3.5小时内荧光强度降低20％，然后急剧加速降解。相反，Glyn-Glyn凝胶在90分钟内完全降解。加入胰蛋白酶3天后获得的完全降解的凝胶产物，然后用SDS-PAGE分析（图5B）。 在 24小时后，Prot-Prot的荧光强度仅轻微降低3％，Glyn-Glyn的荧光强度仅降低5％（图5D），这与检测到的少量糖分释放一致（图5E）。24小时后，O-糖苷酶从Glyn-Glyn释放的糖多于Prot-Prot凝胶（图5E）。

图5 A）胰蛋白酶降解荧光标记的凝胶；B）用胰蛋白酶对完全降解的粘蛋白凝胶进行SDS-PAGE分析; C）蛋白质-蛋白质和聚糖-聚糖交联粘蛋白凝胶的蛋白水解降解示意图；D）带有神经氨酸酶的O-糖苷酶降解凝胶; E）24小时后，O-糖苷酶与神经氨酸酶和O-糖缓冲液释放的粘蛋白浓度。

2.5交联定位影响凝胶对未分化巨噬细胞的生物活性

为了评估材料的生物活性，将 THP-1衍生的M0巨噬细胞（THP-1-M0）与粘蛋白水凝胶接触一天。THP-1-M0粘附在TCP表面，并在所有三种粘蛋白凝胶上形成小细胞聚集体。 作者研究了 THP-1-M0巨噬细胞膜上Siglec-3（图6A），Siglec-5/14（图6B）和Siglec-9（图6C）受体的表达水平和定位。

图6 在 Prot-Prot，Ox Prot-Prot和Glyn-Glyn上培养一天后，THP-1-M0上Siglec表面受体的免疫荧光。

Siglec表达，与底物的结合，在膜处聚集以及细胞内信号传导的同时相互作用是复杂的。整合后，这些事件会导致炎症标志物的上调或下调，而 作者 通过RT-PCR在基因水平上进行了测量（图7）。

图 7. 在TCP，Prot-Prot，Ox Prot-Prot和Glyn-Glyn上培养一天后，THP-1衍生的巨噬细胞的基因表达。

假设交联剂在粘蛋白上的定位直接影响粘蛋白在凝胶中的网络构象，从而导致巨噬细胞膜表面上不同的 Siglec聚集和表达水平，并最终导致M0巨噬细胞的不同激活模式。交联结构会影响粘蛋白分子的排列，从而影响糖残基或聚糖对受体的可及性（图8，顶部）。粘蛋白排列的差异也可能导致不同的配体密度，进而影响膜上的Siglec聚集（图8，底部）。这些结果证实了诸如粘蛋白之类的复杂分子如何与结合剂结合的细节会强烈影响它们的相互作用。

图8 粘蛋白聚糖与细胞表面受体相互作用的插图。 交联结构对糖残基或聚糖对细胞受体的可及性的影响（上图），以及影响细胞受体聚类的局部配体密度（下图）。

【总结】

粘蛋白的蛋白质与蛋白质之间的简单变化与聚糖与聚糖之间的交联之间的简单变化，强烈影响了所得凝胶对蛋白水解裂解的敏感性及其免疫调节活性。 对于粘蛋白生物材料的开发，这一发现增加了可以使用的粘蛋白材料变体的种类，以定义的方式调节免疫系统，增加了粘蛋白类型的选择和酶处理的糖调节。尽管粘蛋白的特殊化学多样性和结构特别适合于创建这两种截然不同的交联结构，但可以对其他大分子装配体（包括蛋白聚糖的水凝胶以及结构蛋白，例如胶原蛋白和血纤蛋白）尝试相同的方法。在这些系统中，调节关键生物活性部分的可及性可以在控制其生物活 性方面提供额外的自由度，尽管其方式目前仍无法预测。

参考文献： doi.org/10.1002/adfm.202008428

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