高效降解柠檬酸酵母菌的筛选鉴定及其在红树莓果汁中降酸特性

红树莓有机酸含量高且主要是柠檬酸，导致红树莓产品口感不佳，糖酸比不协调，限制了红树莓的开发利用。 采用有效方法降低红树莓汁的柠檬酸含量，提高pH值，保留活性成分并形成良好风味，成为了开发红树莓产品的研究重点。

果汁降酸的方法主要包括化学降酸、物理降酸、生物降酸。化学降酸是通过添加降酸剂进行降酸，效果明显，操作简单，但会对原料成分、色泽、风味和稳定性产生一定影响。生物降酸是指微生物以有机酸为碳源，利用并分解有机酸，从而达到降酸目的；一种是苹果酸-乳酸发酵法，不适用于柠檬酸降酸；另一种采用酵母菌发酵，使得有机酸通过相关代谢降解。

目前，对于降低高酸果汁中柠檬酸的菌株及其接种后对果汁有机酸变化影响的研究较少。东北林业大学林学院的陈思睿、唐琳琳和王金玲*等人从红树莓果园泥土和红树莓鲜果中筛选降酸效果最好的菌株，测定发酵过程中有机酸的变化，利用生理生化测定和内转录间隔区（ITS）序列测定对降酸菌株进行鉴定，旨在为降低高柠檬酸果汁酸度及菌株后续的实际应用提供参考。

1 降酸菌筛选

用柠檬酸固体培养基对降酸菌株进行筛选，结果显示，共有8 株菌可利用柠檬酸生长，分别接种到柠檬酸液体培养基中，比较菌株降酸能力，选择降酸速度快且降酸量高的菌株。

由图1可知，不同菌株的降酸效果不同，总酸降低速率均呈先增加后降低趋势。其中来自土壤的菌株T2和来自果实的菌株G4降酸效果最好。在发酵8 d后，菌株T2总酸质量浓度从20 g/L下降到7.25 g/L，菌株G4下降到6.55 g/L，均可降解60%以上的总酸，其他菌株的降酸效果不如这2 株菌，故选择对降酸效果最好的菌株T2和G4进行进一步研究。

2 红树莓果汁降酸效果

将菌株T2和G4分别接入总酸质量浓度（以柠檬酸计）25.16 g/L、pH 3.08的红树莓果汁中，28 ℃静置发酵8 d，以未接菌红树莓果汁为对照，测定发酵过程中不同时间所取样品的总酸和pH值。

由图2可知，对照果汁中总酸和pH值的变化很小，接入降酸菌的果汁与对照果汁相比，变化明显。菌株T2和G4在发酵过程中总酸变化不稳定，但总体呈下降趋势，pH值也相应发生了一定变化。发酵8 d后，菌株T2使果汁总酸质量浓度下降到11.24 g/L，降解果汁中55.32%的总酸，pH值由3.08上升到3.27；菌株G4使果汁总酸质量浓度下降到9.96 g/L，降解果汁中60.41%的总酸，pH值由3.08上升到3.36。

3 红树莓果汁降酸过程中有机酸变化

3.1 样品测定结果

由图3a可知，有机酸混合标准溶液分离效果良好。图3b～d为样品稀释20 倍发酵8 d的检测结果，3号色谱峰为柠檬酸色谱峰，发酵结束后峰面积明显变小，可知降酸菌将红树莓果汁中的 柠檬酸进行了降解。

3.2 降酸发酵过程中有机酸的变化

发酵所使用的红树莓果汁总酸质量浓度为25.16 g/L，柠檬酸质量浓度为22.87 g/L，占总酸的90.9%，所以柠檬酸为红树莓果汁中的主要有机酸，可通过降解柠檬酸进而降低果汁总酸。由图4可知，随着静置发酵时间的延长，接种菌株T2和G4的果汁中柠檬酸含量持续下降，L-苹果酸含量整体均呈下降趋势，琥珀酸含量在第1天增加后呈下降趋势，L-苹果酸和琥珀酸含量均在5～8 d保持在相对稳定的水平，α-酮戊二酸含量在第2天降到最低，之后呈现相似的缓慢波动上升趋势。与0 d的红树莓果汁相比，发酵8 d，菌株T2降柠檬酸效果显著（P＜0.05），柠檬酸质量浓度为9.48 g/L，下降了58.55%，L-苹果酸含量下降了44.67%，琥珀酸含量下降了9.16%；菌株G4降柠檬酸效果也显著（P＜0.05），柠檬酸质量浓度为9.25 g/L，下降了59.54%，L-苹果酸含量下降了43.12%，琥珀酸含量下降了20.29%。

发酵过程中，L-苹果酸含量的缓慢降低可能是菌株在降解柠檬酸的同时降解L-苹果酸。α-酮戊二酸质量浓度在发酵过程中波动可能主要是由代谢积累引起的。α-酮戊二酸是氨基酸和核苷酸生物合成所必需的前体代谢物，它在TCA过程中基本没有净生成，2～8 d含量升高可能是由于一些回补途径合成得到。结果表明，菌株T2有机酸总体变化趋势与菌株G4的变化趋势相似，菌株T2和G4是2 株可分解柠檬酸且降酸能力较强的优良菌株。

4 降酸菌形态特征

菌株T2和G4的形态特征相似，在麦芽汁固体培养基上的形态如图5A所示，菌落为乳白色，菌落较大，呈圆形，具有一定厚度，中间略有凸起，表面光滑、湿润，质地均匀较黏稠，容易挑起，边缘整齐。显微镜观察细胞形态如图5B所示，细胞呈圆形或椭圆形。繁殖方式为芽殖，在酵母产子囊孢子培养基中25 ℃培养3 d，显微镜观察，子囊内产生1～4 个光滑的球形子囊孢子。在麦芽汁液体培养基中28 ℃培养2 d，培养基表面有醭形成。

5 生理生化鉴定

结果显示，菌株T2和G4均能利用葡萄糖，不能利用乳糖、半乳糖、蔗糖等其他糖源，除均能同化葡萄糖、甘油和乙醇外，其他碳源均不能被同化，菌株T2和G4可同化硫酸铵，不能同化硝酸盐。

6 分子生物学鉴定

6.1 菌株的PCR扩增结果

将纯化后的PCR扩增产物进行电泳，在紫外灯照射下观察，结果如图6所示。菌株T2和G4的ITS序列PCR产物电泳样品条带出现在300～500 bp之间，大小均为400 bp左右。

6.2 菌株T2和G4的ITS序列分析与系统发育树的建立

通过对降酸菌的ITS序列进行同源性分析，确定菌株T2和G4种属。菌株T2和G4的ITS序列在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，利用NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）上的BLAST软件与已知菌株序列进行比对分析，并依此构建系统发育树。菌株T2和G4的ITS系统发育进化树如图7所示。

从图7可知，菌株T2和G4与P. terricola和陆生伊萨酵母（I. terricola）的同源性最好，亲缘关系最近。多重序列分析已将伊萨酵母属（Issatchenkia）归入毕赤酵母属（Pichia），这2 个属菌株的亲缘关系较近，可将P. terricola和I. terricola认定为一种菌，即I. terricola。结合上述菌株的形态学特征和生理生化实验结果，确定菌株T2和G4均为I. terricola，并分别重新定名为I. terricola WJL-T2、I. terricola WJL-G4。

结论与讨论

利用柠檬酸培养基对红树莓果园土壤和红树莓鲜果中的酵母菌进行筛选，得到具有良好降解柠檬酸效果的菌株T2和G4，在柠檬酸液体培养基中，菌株T2和G4的总酸降酸率分别为63.73%和67.23%。在红树莓果汁中，菌株T2和G4可分别降解55.32%和60.41%的总酸，58.55%和59.54%的柠檬酸。经生理生化实验及分子学鉴定，结果均为I. terricola，由于降酸速率和效果略有不同，最终将菌株T2和G4分别命名为WJL-T2和WJL-G4，后续可以通过其他测序方法进一步确定2 株菌的关系。

从降酸发酵过程可知，在第8天柠檬酸含量仍有下降趋势，说明降酸率仍有可能增加；实验还发现降酸菌在有氧条件下降酸速率更快，关于2 菌株的最适降酸条件，可综合降酸率和对果汁中活性物质影响等因素，进一步实验摸索。降酸菌的降酸途径较复杂，可能不只TCA代谢一条途径，后续研究还可以测定柠檬酸代谢中的相关酶类活性，更准确深入地研究降酸的途径和机理。本实验结果为降低红树莓果汁酸度、提高果汁品质、研究生物降酸提供一定参考。

本文《高效降解柠檬酸酵母菌的筛选鉴定及其在红树莓果汁中降酸特性》来源于《食品科学》2020年41卷22期133-139页，作者：陈思睿，唐琳琳，冯建文，孙丽娜，王金玲。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191008-024。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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