基于C14-HSL探讨阪崎肠杆菌中信号分子与其生长机制关系

阪崎克罗诺肠杆菌（ Cronobacter sakazakii）作为一种新兴的致病菌是在动物与人肠道中寄生的一种无芽孢、兼性厌氧、有鞭毛的杆状革兰氏阴性菌。许多菌细胞在生长繁殖过程中能够合成一种具有扩散性的小分子化学物质并渗透到细胞外，随细菌密度的不断增大，小分子化学物质的浓度达到临界阈值，此时细菌通过一种称为群体感应（QS）的调控机制感应小分子化学物质，并启动一系列靶基因的表达，从而实现交流过程。目前，已有研究通过信号分子探讨AHLs与其生物被膜形成的关系，根据菌QS信号分子的产生探讨其对食品腐败的影响。本研究通过对不同时间段 C.sakazakii所合成的C14-HSL信号分子实际检测结果，结合预测微生物模型，追踪 C.sakazakii生长周期中AI的生长动态，为进一步阐述该菌的生长机制提供新的思路。

预测模型可以用来评估食品加工的风险，通过预测致病菌与腐败菌的行为从而实施控制措施以保证食品的安全性。作为一个新兴领域，预测微生物学已成为预测食品保质期、质量控制以及风险评估的有用工具。目前已开发出多种用于描述细菌生长的不同类别的预测微生物模型，IPMP（Integrated Pathogen Modeling Program）多应用于病原菌的生长模型，是美国农业部开发的预测细菌生长的模型软件，使用者输入酸碱度、温度、水分活度等影响细菌生长的因素以及初始菌数，即可获得细菌生长曲线以及生长的重要条件和生长数据。

福建农林大学食品科学学院的闫晓彤、罗小娟和方婷*以及福州市疾病控制预防中心的潘洁茹*等人选用C.sakazakii CICC21550菌株为研究对象，通过测定C.sakazakii生长过程中产生的C14-HSL信号分子浓度的变化，将IPMP 2013程序引入C.sakazakii的QS研究中，结合宏观生长预测模型，探究C.sakazakii的生长机制。

1 A.tumefaciens NTL4（pZLR4）检测AHLs信号分子

在提取C.sakazakii AHLs信号分子之前，利用 A.tumefaciens NTL4（pZLR4）生物传感菌再次验证 C.sakazakii CICC21550能够产生AHLs类AI。如图2所示，在底物X-Gal的存在下， C.sakazakii CICC21550能使生物传感菌 A.tumefaciens NTL4（pZLR4）产生蓝绿色反应。该颜色的产生表明 C.sakazakii CICC21550能够合成AHLs类AI。

2 不同生长阶段C.sakazakii AHLs活性的变化

A.tumefaciens NTL4（pZLR4）含pZLR4质粒，在外源酰基长链AHLs存在时诱导产生 β-半乳糖苷酶，水解X-Gal产生蓝绿色。当外源 N-酰基高丝氨酸内酯信号分子的浓度越大， A.tumefaciens NTL4（pZLR4）所表达的 β-半乳糖苷酶的活性越强，因此，通过检测反应体系中 β-半乳糖苷酶的活性变化在一定程度上可间接反映 N-酰基高丝氨酸内酯信号分子的含量多少。如图3所示， C.sakazakii CICC21550生长期间AHLs的活性检测表明，不同培养时间下 C.sakazakii CICC21550所合成的AHLs的活性存在差异。此外，AHLs的活性随细菌细胞密度的增大而增大，具有密度依赖性，当细菌细胞生长达最大值（18 h）时， C.sakazakii CICC21550所合成的AHLs的活性达最大，随后细菌细胞的生长繁殖处于稳定期甚至衰亡期， C.sakazakii所合成的AHLs的活性逐渐下降。

3 37 ℃条件LB液体培养基中C.sakazakii的生长拟合曲线

Huang模型、Baranyi模型以及Gompertz模型的拟合参数AIC以及RMSE数值越小表示数据在模型中的拟合度越高。结合模型拟合曲线（图4）可发现，Huang模型及Baranyi模型具有较高的拟合度。此外，根据拟合参数，Huang模型的AIC以及RMSE数值均小于Baranyi模型与Gompertz模型。由此可见，Huang模型是37 ℃条件下C.sakazakii CICC21550在LB培养基中生长的最佳拟合模型。

4 37 ℃条件下C.sakazakii的生长过程中C14-HSL浓度变化的拟合曲线

为进一步从微观角度探究C.sakazakii的生长机制，根据UPLC-MS/MS定量检测AHLs的方法，检测不同培养时间条件下C.sakazakii CICC21550所合成的C14-HSL信号分子的浓度，应用Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型拟合C14-HSL浓度数据，拟合曲线如图5所示。C14-HSL信号分子的浓度随C.sakazakii CICC21550的生长具有一定规律性，呈先上升后下降的趋势。根据模型拟合参数，Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型对C14-HSL均具有较好的拟合度，各拟合模型曲线具有明显的迟滞期。其中，Baranyi模型的RMSE和AIC的值分别为0.268和-16.449；Huang模型的RMSE和AIC的值分别为0.238和-19.356；Gompertz模型的RMSE和AIC的值分别为0.376和-8.345。当RMSE和AIC的值越小说明曲线的拟合性越好，所以由以上数据可知Baranyi模型可以很好的模拟37 ℃条件下C.sakazakii的生长过程中C14-HSL浓度变化的曲线。通过Baranyi模型拟合得到的C14-HSL信号分子的最大浓度Ymax的值为8.535，最大生成速率μmax的值为0.825。

可见，IPMP程序不仅适用于细菌生长的模型拟合，对于微观角度细菌QS的AI模型拟合同样适用。此外，结合37 ℃ LB液体培养基中C.sakazakii的生长拟合模型，对比表2与表3的拟合参数可以发现C14-HSL信号分子的产生与细菌的生长存在正相关，并且C14-HSL信号分子产生的迟滞期明显比C.sakazakii CICC21550细菌生长的迟滞期长，可见细菌QS系统的启动要建立在细菌生长适应环境之后的基础上。

结 论

本实验主要探究C.sakazakii生长过程中C14-HSL信号分子的合成规律，利用IPMP程序建立了阪崎肠杆菌数量、C14-HSL信号分子与时间的关系，追踪C.sakazakii生长周期中AI的生长动态，结合细菌生长的宏观模型，为进一步阐述该菌的生长机制提供新的思路。结果表明：1）C.sakazakii CICC21550在对数生长初期就有检出C14-HSL信号分子，在细菌生长的稳定期达最大值，随后呈逐渐下降趋势，具有明显的密度依赖性。通过Baranyi模型拟合得到的C14-HSL信号分子的最大浓度Ymax的值为8.535，最大生成速率μmax的值为0.825。2）IPMP程序不仅适用于细菌生长的模型拟合，对于微观角度细菌QS的AI模型拟合同样适用。Baranyi模型、Huang模型以及Gompertz模型等一级模型对C14-HSL均具有较好的拟合度，各拟合模型曲线具有明显的迟滞期，且迟滞期明显比细菌生长的长。

本文《基于C14-HSL探讨阪崎肠杆菌中信号分子与其生长机制关系》来源于《食品科学》2020年41卷18期134-139页，作者：闫晓彤，罗小娟，潘洁茹，叶海梅，林侃，李长城，方婷。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190802-037。