Nature Methods | RNA分子快速冷冻电镜结构解析方法

撰文 | Leon

责编 | 雪月

许多RNA分子可以折叠成复杂的三维结构，并具备基本的生物功能，包括调节基因的表达，感知小分子和催化反应的进行。这些生物学功能的实现往往不需要其他蛋白的帮助【1，2】。人类基因组的80%会被转录为RNA，而只有1.5%编码了蛋白质【3，4】。Protein Data Bank里面只有不到1500个RNA结构，而蛋白结构约有147000个。对RNA结构的了解可以增加我们对RNA序列-功能关系的理解，辅助功能性RNA分子的设计。然而，RNA分子构象的异质性太大，特别是在缺乏蛋白因子的情况下，传统技术如X射线晶体学和核磁共振难以用于确定RNA的结构。

单颗粒冷冻电镜的发展使人们可以确定大分子量的蛋白质-RNA复合体的结构。但是，不包含蛋白质的RNA分子通常太小，且构象不均一，难以使用单颗粒冷冻电镜来分析它们的结构。迄今为止，冷冻电镜只解析了一个无蛋白RNA分子的结构：分辨率为9的HIV-1的dimerization initiation signal （DIS） ，而且还需要核磁共振的辅助【5】。

近日，美国斯坦福大学的Wah Chiu和Rhiju Das课题组在Nature Methods发表了题为Accelerated cryo-EM-guided determination of three-dimensional RNA-only structures的论文，开发出用冷冻电镜快速测定RNA结构的流程，命名为Ribosolve。

Ribosolve的流程整合了冷冻电镜、生化方法M2-seq （mutate-and-map sequencing） 和计算机建模工具DRRAFTER来解析RNA的结构。整个流程大大节约了人力物力，研究人员得以在相对短的时间内 （几个月） 解析了11个RNA结构，长度为60到400 nt，包括一些核糖开关 （riboswitch） 、核酶 （ribozyme） 和人工合成的RNA结构（图1和2）。尽管没有达到原子级别的分辨率，Ribosolve已经可以展现出分辨率为4.7到10 的RNA分子整体的三维结构。通过Ribosolve，研究人员可以分析RNA与其他因子结合引起的构象变化，并验证RNA结构预测的准确性。

图1. 部分RNA分子的冷冻电镜

图2. 用Ribosolve解析的部分RNA结构（每个RNA螺旋都用不同的颜色标记，非螺旋区域标记为灰色。）

Rosetta auto-DRRAFTER的使用大大缩短了建立模型的时间，提高了Ribosolve方法的准确度。这些RNA结构的解析为研究它们的功能提供了新的见解。比如，hc16 ligase向右上突出的臂赋予了它额外的催化功能。这些工作为今后类似的RNA结构研究提供了新的指导。

参考文献

1. Atkins, J. F., Gesteland, R. F. & Cech, T. RNA Worlds: From Life’s Origins to Diversity in Gene Regulation (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011).

2. Cech, T. R. & Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution—trashing old rules to forge new ones.Cell157, 77–94 (2014).

3. Lander, E. S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome.Nature409, 860–921 (2001).

4. Hangauer, M. J., Vaughn, I. W. & McManus, M. T. Pervasive transcription of the human genome produces thousands of previously unidentified long intergenic noncoding RNAs.PLoS Genet. 9, e1003569 (2013).

5. Zhang, K. M. et al. Structure of the 30kDa HIV-1 RNA dimerization signal by a hybrid Cryo-EM, NMR, and molecular dynamics approach.Structure26, 490–498.e3 (2018).

https://www.nature.com/articles/s41592-020-0878-9