Neuron | 基于荧光酶颜色转换成像技术发现新的生物钟神经调节机制

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在哺乳动物中，下丘脑视交叉上核（SCN）是生物钟昼夜节律的主起搏器，控制着机体内与昼夜交替相关的行为和状态，比如睡眠-觉醒、进食规律、体温和内分泌的昼夜涨落。作为下丘脑内的一个神经核区，SCN包含约10,000多个各个类型的神经元，每一个神经元都拥有自主的周期性震荡功能，神经元之间又通过神经突触的电生理联接和其他信号转导作用相互耦合，组成一个三维集成网络，成为一个稳定的高精度高相干授时器。SCN分泌100多种已确定的神经递质、神经肽、细胞因子和生长因子。产生神经肽的神经元中有两个主族，AVP（arginine vasopressin精氨酸加压素）神经元和VIP（vasoactive intestinal peptide血管活性肠多肽）神经元，分别位于SCN的“外壳”和“内核”区域（core and shell）。内核区域的神经元通过联接到视网膜-下丘脑神经束（RHT）直接接受来自视网膜的光信号，并激发下游的电生理联接和神经信号分子转导，使SCN神经元震荡的周期长度和相位关系与自然界的昼夜节律维持同步。即使没有外界昼夜节律的驱动， SCN仍能依靠自主的周期性震荡，维持生物体的生物钟功能和接近昼夜周期的节律运转。VIP/VPAC2R（内核区神经肽/受体）信号传导在维持SCN自主节律和光驱动的节律调节两个过程中都发挥重要功能【1】。AVP V1a/ V1b （外壳区神经肽/受体）信号传导也可能介导SCN神经元之间相互作用，保持SCN网络的同步性【2】。SCN中不同神经元类型所发挥的特异性功能，尤其是外壳区（shell）神经元的功能还未明确。

为了研究SCN神经元类型在光驱动节律和自主节律这两中情况下的细胞类型特异性功能，2020年8月7日，德克萨斯大学西南医学中心的Joseph S. Takahashi团队（第一作者为Yongli Shan博士）在Neuron上发表文章Dual-Color Single-Cell Imaging of the Suprachiasmatic Nucleus Reveals a Circadian Role in Network Synchrony，通过基因工程构建出颜色转换小鼠模型，发现外壳区AVP神经元的昼夜节律对于SCN网络同步和SCN神经元总体的耦合至关重要。

研究人员通过基因工程培养了带有颜色转换DNA模块的Per2基因敲入（Knock-in）干细胞株系，并培育了颜色转换小鼠品系 (Color-Switch PER2 :: LUCIFERASE mouse line) 。在这个颜色转换模块中，红色荧光素酶基因Click beetle red（CBR）与Per2表达框（ORF）的C末端相融合，并嵌入了一对Loxp位点，在Cre重组酶的作用下发生DNA模块的重组切除（flox-out），同时拼接替换为绿色荧光素基因Click beetle green（CBG）。Cre-loxp作为DNA重组的驱动器，在基因工程中得到广泛运用。而细胞类型特异性基因驱动表达的Cre转基因小鼠品系，也是精准研究细胞类型特异性功能的重要的遗传学工具【3】。当本文中的颜色转换小鼠与特定的细胞类型特异性Cre小鼠相杂交，在生成的双转基因小鼠的体内，表达Cre的细胞类型就会发生颜色转换，从而表达携带着绿色荧光素酶的PER2融合蛋白，而其他不表达Cre的细胞类型仍然表达携带着红色荧光素酶的PER2融合蛋白。哺乳动物的Per (Period) 家族基因是经典的生物钟基因和转录因子，Per2的表达量随着昼夜节律发生精确、稳定的高幅涨落，形成分子潮汐，调控节律相关的基因表达和功能调控，Per2也常被用作生物钟功能的报告分子【4】。

叩甲虫荧光素酶（Click beetleluciferase）家族被选用于红色/绿色分离，取代了最常用的萤火虫（Fire fly）荧光素酶家族。因为萤火虫荧光素酶的波长/颜色对pH敏感，无法用于稳定的颜色分离。叩甲虫萤光素酶的亮度也比萤火虫萤光素酶高2-5倍【5】。而荧光素酶在生物体内（in vivo）发光成像中，由于其无需激发光也无光毒性，极低的背景和高信噪比，一直被用于长程、实时观测基因转录和蛋白表达的昼夜节律。为了捕获并分离来自PER2-CBR和PER2-CBG的红色和绿色荧光信号，研究者们还开发了一种双色成像设备，该设备采用高数值孔径（numeric aperture）镜头采光，运用分束器（beam splitter）将样品的荧光素酶发光信号分隔成长波束和短波束。两束光分别用长通滤光片和短通滤光片过滤，以分离绿色和红色光信号。然后绿色和红色通道图像被聚焦到低温CCD照像机感光芯片的左右两边，便实现了逐帧、完全同时的红色和绿色通道的图像获取，避免了曝光时程给不同通道成像带来的时差。

研究者们利用新型颜色转换品系与AVP-Cre或VIP-Cre神经肽标记品系杂交，实现了对SCN外壳型神经元或内核型神经元的特异性颜色标记，并在离体（ex vivo）脑切片SCN培养中进行实时、双色、活体成像，结果观测到了接近24小时昼夜周期的双色自主节律。Cre神经元的特异性绿色荧光素酶信号在SCN中的定位与之前报道的AVP和VIP神经元的定位相吻合，验证了荧光素标记的细胞类型特异性颜色转换。

研究者们进一步培育了携带颜色转换基因、Cre神经肽标记和Bmal1可诱导敲除（conditional knockout）的三品系杂交小鼠。Bmal1是另一个生物钟转录通路的核心转录因子，Cre诱导的Bmal1敲除可以特异性的破坏携带Cre的细胞类型中的生物钟功能，导致其丧失自主节律。而当一部分SCN神经元丧失自主节律时，如果SCN的神经元网络联接足够强时，其他没有携带Cre因而Bmal1也没有被敲除的神经元，可能会通过神经元之间联接驱动那些失去Bmal1的神经元，使SCN网络中联接在一起的神经元发生耦合，恢复节律。在过去的研究中，研究人员认为这种耦合-驱动效应的效率，主要取决于SCN网络中具有自主节律的神经元的比例【6】。而本文的研究者们借助他们研发的颜色转换报告基因，可以用图像的颜色通道信息，在单细胞水平上清晰的分辨缺失Bmal1的绿色神经元和其他正常的红色神经元，加以分析比对。他们惊讶地发现，除了神经元的数量比例，SCN耦合-驱动的效应更加取决于神经元类型。在SCN的离体脑切片培养和双色荧光素成像系统中，SCN外壳区的AVP神经元的自主节律对SCN网络的同步性至关重要，因为Bmal1在AVP神经元中的特异性敲除会导致整个SCN网络的“失联”，网络的同步性被破坏，其他非AVP神经元即使拥有正常的Bmal1和自主节律，也无法进行耦合，发生了神经元总体的相位散乱。在动物行为水平上AVP-Cre x Bmal1 小鼠的昼夜活动节律的周期稳定性受到了影响，在关闭外界光照的刺激环境中，小鼠的运动节律周期逐渐拉长，印证了SCN成像实验中的发现。在平行实验中，当SCN核心区的VIP神经元的自主节律丧失后，却能够借助其他非VIP神经元形成的局域网络所产生的耦合驱动，重新获取节律，恢复SCN网络的整体同步性。VIP-Cre x Bmal1小鼠的昼夜活动节律也完全正常。

研究者们还使用了河豚毒素（Tetradotoxin），一种常用的钠离子通道抑制剂，来抑制SCN神经元的动作电位和神经活动的传导。在冲洗SCN去除河豚毒素后，VIP-Cre x Bmal1小鼠的SCN能够重建正常神经网络实现同步，说明缺失了Bmal1的VIP神经元能够与SCN网络耦合获取节律。而AVP x Bmal1小鼠的SCN，在去除河豚毒素后，依然无法实现神经网络重建。AVP神经元因为缺失了Bmal1而丧失了自主节律，而且无法与其他非AVP神经元进行耦合，而非AVP神经元虽然仍然保持自主节律和Per2蛋白表达高幅的震荡，在这种情况下却也无法实现相互耦合。

为了深入了解VIP和AVP神经元在SCN中的不同作用，研究者们还用计算机算法模型开发了由三类代表性神经元(AVP, VIP和其他)所组成的SCN神经网络的简单随机（Stochastic）模型。通过模拟演算VIP和AVP神经元的耦合强度和数量丰度的变动，发现SCN外壳区AVP神经元的自主节律缺失对SCN网络影响可能源于这种神经元较强的耦合能力。而核心区的VIP神经元和中部区的其它类神经元则耦合较弱。

本文的研究者们通过离体，体内和计算机模拟结果，发现并验证了一种SCN神经网络和生物学功能的模型。在这个模型中外壳区AVP神经元的昼夜节律对于SCN网络同步和SCN神经元总体的耦合至关重要，AVP神经元的驱动甚至可以补偿核心区VIP神经元自主节律的缺失。在白天的时候，VIP神经元从视网膜接收光信号，并激活SCN网络的相位耦合，与自然界的节律建立同步。但在没有光激活的情况下，VIP神经元的自主昼夜节律对于维持SCN网络的同步性并不完全必要。相比之下，AVP神经元需要自主的昼夜节律来执行其作用，负责维持SCN网络的自主同步。在夜晚没有光的情况下，通过AVP神经元较强的耦合作用，驱动其他类型神经元的同步化，维持SCN网络的节律性振荡。总而言之，光驱动节律和自主节律通过特异性的SCN神经元类型之间的分工、协作，实现了生物时钟的可塑性和韧性完美平衡。

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.07.012

制版人：十一

参考文献

1. Hastings, M.H., Maywood, E.S., and Brancaccio, M. (2018). Generation of circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus.Nat Rev Neurosci19, 453-469.

2. Yamaguchi, Y., Suzuki, T., Mizoro, Y., Kori, H., Okada, K., Chen, Y., Fustin, J.M., Yamazaki, F., Mizuguchi, N., Zhang, J., et al. (2013). Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.Science342, 85-90

3. Taniguchi, H., He, M., Wu, P., Kim, S., Paik, R., Sugino, K., Kvitsiani, D., Fu, Y., Lu, J., Lin, Y., et al. (2011). A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.Neuron71, 995-1013.

4. Yoo, S.H., Yamazaki, S., Lowrey, P.L., Shimomura, K., Ko, C.H., Buhr, E.D., Siepka, S.M., Hong, H.K., Oh, W.J., Yoo, O.J., et al. (2004). PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.Proc Natl Acad Sci U S A101, 5339-5346.

5. Miloud, T., Henrich, C., and Hammerling, G.J. (2007). Quantitative comparison of click beetle and firefly luciferases for in vivo bioluminescence imaging.J Biomed Opt12, 054018.

6. Low-Zeddies, S.S., and Takahashi, J.S. (2001). Chimera analysis of the Clock mutation in mice shows that complex cellular integration determines circadian behavior.Cell105, 25-42.