技术进步 | 多片段Gibson Assembly的优化

撰文 | Leon
责编 | 雪月

把各种线性DNA分子组装在一起是分子生物学实验中不可或缺的部分。人们一般依赖于限制性内切酶和DNA连接酶来完成这些操作，如把一段DNA插入到质粒中【1】。由J. Craig Venter Institute的Daniel Gibson等人在2009年发明的Gibson Assembly则不需要用上述的“剪切/粘贴”的方法【2】。无论DNA片段的长度如何，在三种酶的介导下，多个片段可在单一反应中连接成完整的双链DNA分子。Gibson Assembly被证明是一种高效组装质粒的方法，在全世界范围内得到广泛使用。

首先，两端有同源部分的DNA片段在T5外切酶的作用下，3’同源部分被暴露出来，互相进行配对重组。然后，DNA聚合酶会把缺口补齐。最后在DNA连接酶的作用下，单链裂口得到了修复（见下图）。但是，Gibson Assembly并不完美，多片段（超过5个）组装的效率和精确度还有待提高。T5外切酶有单链内切酶的活性，会破坏3’端的同源臂，导致3’端单链部分的破坏，影响片段的重组【3】。

Gibson Assembly的三个步骤

2020年6月15日，哈佛医学院的Constance Cepko实验室在bioRxiv发布了题为A Simple Enhancement for Gibson Isothermal Assembly的论文，通过向反应体系添加一种单链DNA结合蛋白，抑制了T5外切酶对3’端的破坏，减少了3’端二级结构的形成，提高了Gibson Assembly的效率和精确度。

作者用pUC19质粒进行两片段或六片段的Gibson Assembly，然后转化大肠杆菌。如果两片段的Assembly成功，转化后的大肠杆菌会表达绿色荧光蛋白；如果六片段的Assembly成功则同时表达绿色和红色荧光蛋白（见下图）。

Assembly反应的实验设计

与传统Gibson Assembly和New England Biolabs的HiFi DNA Assembly Master Mix（NEB E2621）相比，添加了单链DNA结合蛋白（NEB M2401S）的Gibson Assembly效率和准确度更高（见下图）。进行多片段Gibson Assembly时，这种差异更加明显。

反应结果的量化比较

这种单链DNA结合蛋白的作用机制尚不明确。它或许可以保护单链DNA免受内切酶的攻击，并且促进单链间的杂交。这种改进非常简便且成本较低，有助于解决多片段Gibson Assembly成功率低的难题。

单链DNA结合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）的作用机制

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.14.150979v1.full

参考文献

1. Cohen, S.N., et al., Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro.Proc Natl Acad Sci U S A,1973. 70(11): p. 3240-4.

2. Gibson, D.G., et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods, 2009. 6(5): p. 343-5.

3. Sayers, J.R. and F. Eckstein, A single-strand specific endonuclease activity copurifies with overexpressed T5 D15 exonuclease.Nucleic Acids Res, 1991. 19(15): p. 4127-32.