川南腌菜耐盐生香酵母的筛选、鉴定及特性

川南腌菜主要以内江大头菜、宜宾芽菜为代表，经食盐高渗、微生物发酵、蛋白质分解及脱水加工制成，具有美味脆爽、咸鲜辛辣等风味特点，含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质，具有开胃健脾的功效，深受广大消费者青睐。目前，对于川南腌菜的研究主要集中于衍生产品的开发、风味及营养物质的分析、细菌群落分析、乳酸菌的筛选、菌相等方面的研究，而对生香酵母的研究较少。生香酵母作为发酵产品风味形成的重要菌株，目前已有诸多研究。

传统自然发酵腌菜微生物体系复杂，主要优势菌群是乳酸菌与酵母菌，乳酸菌产生乳酸及细菌素，在腌菜发酵过程中主要抑制致病菌的生长，而要形成腌菜独特的风味需要乳酸菌与酵母菌的共同作用。一般自然发酵的微生物体系不稳定、极易受自然环境的影响，产品难以达到标准化、工业化，极大地限制了腌菜的发展，所以腌菜发酵菌剂的制备具有重要现实意义，而生香酵母的筛选为腌菜发酵菌剂的制备奠定了基础。

盐是腌菜制作过程中必需的原料，影响其感官特性与安全性。使用适当浓度的盐在有效促进有益微生物生长的同时，还可以提高腌菜的感官品质，保证腌菜的质量和风味。目前市场上的腌菜主要是传统工艺生产而成，含盐量较高（含NaCl 10%～20%），但随着人们健康意识的提升，低盐及新工艺腌菜（含NaCl 3%～9%）存在巨大发展空间。为解决这一问题及适应市场的需求，四川轻化工大学生物工程学院的唐红梅、王浩文和四川旅游学院的邓静*等人期望从川南腌菜中筛选出耐盐幅度广（耐NaCl 3%～15%）、生香能力强的酵母菌，并对其特性进行初步研究，以期为更深入探究及生香酵母活菌剂的制备奠定基础。

一、样品理化性质测定结果

根据GB 5009.44—2016与GB/T 10468—1989对样品的含盐量及pH值进行测定，发现样品B、C、D、F的含盐量均低于文献所述，可能是由于样品是经过脱盐处理或者是低盐工艺加工而成的。6 个样品整体pH值偏低，可有效抑制腌菜中腐败菌的生长。

二、耐盐酵母菌的筛选

分离出酵母疑似菌179 株，后经YPD培养基划线纯化后对照标准酵母菌形态，初步筛选出形态具有较明显差异的酵母菌121 株。由实验可知，所有菌株均可耐受质量分数9% NaCl且能较好生长。结果显示，51 株酵母菌能够耐受质量分数15%的NaCl。选取在15% NaCl耐盐能力中等及以上的26 株菌进行更高盐浓度耐受实验。从川南腌菜中筛选得到的酵母菌株最高可耐15% NaCl，在18% NaCl下生长受到了严重抑制。

三、生香酵母的筛选

3.1 感官筛选结果

选择耐15% NaCl较好的26 株菌，根据感官筛选出能产生较明显的酯香、醇香或其他香气的15 株酵母菌：YC4、YC17、YA2、YD11、YC14、YF24、YB6、 YB10、YF17、YB4、YB14、YF21、YB18、YC5、YC9。

3.2 理化筛选结果

• 总酯测定结果

采用皂化回流法对感官嗅闻生香能力较强的15 株菌进行总酯的测定。由图1可知，培养72 h后发酵液中总酯含量较高的酵母菌株为YF17、YB4、YC14、YB18、YB14，菌株YF17、YB4的产酯能力最强，分别为1.75、1.66 g/100 mL；菌株YC14、YB18次之，分别为1.37、1.34 g/100 mL。

• 总酸测定结果

采用滴定法对发酵液中的总酸含量进行测定，由图2可知，菌株YB4的产酸能力最强，YC4次之，YB14最弱。菌株YB4 72 h总酸质量分数为0.225%，比YC4高1.71倍，比YB14高12.24倍。

• 产醇实验结果

酵母发酵产生的乙醇具有微香，并且可与酸结合生成酯增加腌菜的风味。经TTC显色实验，根据菌落颜色深浅判断各菌株产醇能力的强弱。由表8可知，YC14、YB4的产醇能力最优。根据产酯、产酸及产醇能力的测试结果，综合分析筛选出生香能力最优的菌株YB4、YB18、YC14、YF17。

四、菌株的鉴定

4.1 形态学鉴定

将筛选出的4 株优势菌，平板划线接种于PDA、YPD、孟加拉红培养基上进行形态观察，结果见图3。4 株酵母菌在3 种培养基上菌落呈现出不同的形态特征及颜色，其中YB4、YB18在孟加拉红培养基上呈现深红色，YC14、YF17呈现的粉红色；YB4细胞形态为圆形或卵圆形，YB18、YC14、YF17细胞形态为卵圆形。

4.2 菌株分子鉴定

将PCR扩增得到的单一DNA片段，经1%的琼脂糖凝胶电泳得出700 bp左右的扩增条带，扩增图谱见图4。将ITS测序结果输入NCBI中进行BLAST比对，选取同源性较高的模式菌株运用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，且Bootstrap对进化树进行1 000 次可信度分析，见图5。YF17经多次纯化后多次测序，结果均显示为双峰，应用ITS测序的方式不能进行准确鉴定，可能是由于ITS测序方式不适用于YF17的鉴定。

五、4 株酵母菌生长曲线与pH值的变化情况

结果显示，YB4在24 后进入稳定生长期；YB18在30 h后出现一定程度的衰亡；YC14在24 h后进入稳定期；YF17在20 h后进入稳定期。以上可以看出，相同接种量、培养条件下，YB4、YC14、YF17的细胞稳定性优于YB18；YF17最先进入稳定期；酵母菌在pH 3.8～6.0的范围内能够较好地生长，因此4 株菌产生的pH值环境均在各自生长能接受的范围内。

六、4 株酵母菌总酸的变化情况

通过测定培养过程中总酸的变化，可以反映菌株自身的生香特性及不同NaCl浓度对菌株生香的影响。由图7可知，与对照组相比，不同质量分数的NaCl对YB4产酸均产生了不同程度的抑制且各盐度下YB4总酸变化情况不同：对照组总酸含量呈急剧下降后缓慢上升最后再下降的变化趋势；6%NaCl下，12～48 h总酸含量出现较小幅度的降低，48 h后总酸含量发生增加；在9%、15%的NaCl质量分数下，总酸含量呈先下降后上升再下降后缓慢上升的规律性变化；在12% NaCl下，总酸含量先降低后上升最后趋于稳定。通过纵向比较发现：在12～72 h，各实验组的总酸含量与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。

由图 8 可知，在 12 ～ 60 h ，与对照组相比， 6 % 、 9 % 、 12 % 、 15 % 质量分数的 NaCl 均对 YB18 产酸量产生了明显抑制（ P ＜ 0.05 ）。培养至第 72 小时， 6% NaCl 下的总酸含量显著高于其余各实验组（ P ＜ 0.05 ），可能由于 YB18 的适盐能力的激发，一定程度的含盐量反而有利于产酸能力的增强。

由图9可知，YC14在各NaCl质量分数下的总酸含量整体呈上升趋势，9% NaCl总酸含量与对照组变化规律一致；60 h后6% NaCl下YC14的总酸含量明显增加，至第72小时总酸含量接近对照组，这与YB18在6% NaCl下的总酸变化规律相似。从纵向分析，培养时间为12～60 h时，6%、9%、12%、15% NaCl均对总酸含量有明显的抑制作用（P＜0.05）；培养72 h，6% NaCl下的总酸含量与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。

由图10可知，对照组与6%NaCl下总酸含量变化趋势一致，9%、15%NaCl下总酸含量变化趋势一致，12%NaCl下总酸含量在12～24 h下降，24～72 h上升后又趋于稳定。在培养过程中总酸量出现下降可能是由于部分酸挥发或与醇类结合生成酯。从纵向比较，第72小时时，6%、9%、12%、15%NaCl的总酸含量显著低于对照组（P＜0.05）。

由图7～10可知，在第72小时，YB4的总酸含量比YC14与YF17的总酸含量低，这与上述结果有异，原因可能是由YB4生长特性、接种量多少、培养基体积、取样方式不同造成。

讨 论

• 耐盐生香酵母的筛选、鉴定
  

通过梯度耐盐筛选、感官与理化相结合的方式从川南腌菜中筛选出4 株耐盐幅度广（3%～15%NaCl）生香能力强的酵母菌株YB4、YB18、YC14、YF17，经ITS rDNA鉴定结果分别为M.guilliermondii、D.hansenii、C.parapsilosis，其中YF17经多次纯化后测序结果均为双峰，表明ITS rDNA测序方式并不适用于所有真菌的鉴定。

• 4 株酵母菌生长情况及pH值变化

对4 株菌的生长情况及培养过程中的pH值进行测定发现，在相同接种量、培养条件下，YF17最先进入稳定期；YB4、YC14、YF17的细胞稳定性优于YB18；4 株菌产生的pH值环境均在各自生长能接受的范围内。

• 4 株酵母菌总酸变化情况

对4 株菌的总酸进行测定，结果显示，与对照组相比，6%、9%、12%、15% NaCl对4 株菌产酸情况的影响不同。总体来说，培养过程中6%、9% NaCl对菌株YB4、YB18产酸能力的抑制低于质量分数12%、15% NaCl；6%NaCl对菌株YC14、YF17产酸能力的抑制低于其余3 种NaCl质量分数。YB18、YC14在培养过程中可能由于适盐能力的激发，6% NaCl反而有利于产酸能力的增强，当培养60 h后总酸含量出现大幅上升。

结 论

本研究以川南名腌菜各部位（A、B、C、D、E、F）为原料，采用梯度耐盐筛选、感官与理化相结合的方式筛选出4 株耐盐幅度广（3%～15% NaCl）、生香能力强的酵母菌株，经ITS rDNA鉴定，结果为YB4（M.guilliermondii）、YB18（D.hansenii）、YC14（C.parapsilosis），YF17不能由ITS rDNA测序方式进行准确鉴定。3 株菌（YB4、YC14、YF17）的细胞稳定性较好，所有菌株产生的pH值均在生长能接受的范围内。12%、15%NaCl对菌株YB4、YB18产酸能力的抑制作用较强；质量分数6%NaCl对菌株YC14、YF17产酸能力的抑制作用较弱。培养过程中，YB18、YC14在质量分数6%NaCl中产酸能力增强，可能是由于菌种适盐性的激发。本研究筛选出4 株耐盐幅度广（质量分数3%～15%NaCl）生香能力强的酵母菌株，为腌菜发酵菌剂的制备提供了理论支持。

本文《川南腌菜耐盐生香酵母的筛选、鉴定及特性》来源于《食品科学》2020年41卷12期150-157页，作者：唐红梅，王浩文，吴华昌，邓静，刘阳，王艺瑾。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190509-092。点击下 阅读原文 即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅