鼠尾草酸通过激活AMPK降低游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪积累

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是除酒精外其他因素导致的肝损伤，包括单纯的脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎和肝硬化，该病与炎症因子增加、脂质代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压、2型糖尿病等密切相关，脂肪的过度摄入是诱发NAFLD的重要因素。目前NAFLD的发病机制尚不明确，最初认为是由胰岛素抵抗引起的，但是近几年的研究表明由肥胖导致的肝脂肪积累，以及肝脂肪变性等同样会引起NAFLD。临床上还没有公认的治疗NAFLD的标准药物，一些降脂药，寻求一种药食同源的天然产物对于辅助治疗NAFLD疾病具有重要意义。

鼠尾草酸是一种从迷迭香中提取的双萜类化合物（图1），具有抗细胞突变、抗氧化、抗炎等作用。目前鼠尾草酸抗肿瘤研究已经成为热点，但在降脂方面的研究较少且作用机制并不明确，前期研究表明迷迭香具有降低高脂饮食小鼠体内胆固醇的作用。游离脂肪酸（FFAs）常被用于诱导高脂损伤模型，研究药物或者天然产物的降脂作用。因此天津科技大学食品工程与生物技术学院的程静、刘莹和王浩*等人采用FFAs诱导HepG2细胞NAFLD变性模型，研究鼠尾草酸对FFAs诱导的肝脂肪变性的作用机制，以期为其在降脂功能产品中的应用提供有益参考。

1 鼠尾草酸对细胞的毒性作用

与正常组相比25 μmol/L的鼠尾草酸能显著抑制细胞的活性（P＜0.05），使细胞的活力大约降低至85%。Compound C 2 μmol/L处理细胞对细胞的活力无显著性影响。各组与正常组相比均无显著差异，因此以1 mmol/L FFAs、15 μmol/L和20 μmol/L鼠尾草酸及2 μmol/L Compound C用于后续实验。

2 鼠尾草酸对FFAs诱导的脂肪积累的影响

鼠尾草酸对FFAs诱导的HepG2细胞脂肪积累的作用如图3所示，FFAs组吸光度显著高于正常组（P＜0.05），约为正常组的2 倍。不同浓度的鼠尾草酸处理细胞后，吸光度显著降低（P＜0.05），表明鼠尾草酸能显著降低细胞内脂肪含量且作用效果呈浓度依赖型。抑制剂组吸光度显著高于高剂量药物组（P＜0.05），这说明鼠尾草酸的降脂作用可能和AMPK相关。

3 鼠尾草酸对细胞内TC、TG水平的影响

结果显示，FFAs处理组细胞能显著增加TC、TG的水平，TC含量约高于正常组细胞的2 倍，TG含量约高于正常组细胞的3 倍，差异极显著（P＜0.01）。不同浓度的鼠尾草酸处理FFAs诱导的HepG2细胞，能显著降低细胞内TC、TG含量（P＜0.05），其中TC含量从0.085 μmol/mg减低到0.05 μmol/mg，TC含量从0.142 μmol/mg减低到0.075 μmol/mg。与高剂量鼠尾草酸组相比，抑制剂组能显著逆转鼠尾草酸的作用且具有显著性差异。这些结果说明在实验浓度下鼠尾草酸能显著降低由FFAs诱导的HepG2细胞内TC、TG含量，且这些作用与AMPK相关。

4 鼠尾草酸对FFAs诱导的脂肪相关基因表达的影响

结果显示，FFAs组细胞内SREBP-1C、FAS、ACC和SREBP-2的基因表达水平显著高于正常组（P＜0.05），同时CPT-1和PPARα的基因表达水平显著低于正常组（P＜0.05）。不同浓度鼠尾草酸处理HepG2细胞能显著降低FFAs诱导的SREBP-1C、FAS、ACC、HMGCR和SREBP-2的基因表达水平（P＜0.05），同时鼠尾草酸能显著增加FFAs诱导的CPT-1和PPARα基因表达的水平（P＜0.05），作用效果表现为浓度依赖型。抑制剂组能显著逆转鼠尾草酸诱导的脂肪代谢基因的变化（P＜0.05）。这些结果表明鼠尾草酸能显著上调FFAs诱导的HepG2细胞中脂肪氧化相关基因的表达水平和下调脂肪合成相关基因的表达水平，从而降低细胞内脂肪的积累，且这些作用与AMPK密切相关。

5 鼠尾草酸对FFAs诱导的磷酸化AMPK蛋白表达的影响

由图6可知，与正常组相比，FFAs组AMPK磷酸化蛋白的表达无显著差异，而不同浓度的鼠尾草酸处理HepG2细胞能显著上调AMPK磷酸化蛋白的表达水平（P＜0.05），说明鼠尾草酸能激活AMPK的磷酸化。Compound C处理细胞能显著抑制AMPK的磷酸化蛋白的表达，降至高剂量组的50%（P＜0.05）。上述结果表明鼠尾草酸能激活AMPK蛋白的磷酸化。

6 鼠尾草酸与AMPK分子对接结果分析

如图7所示，分析了3 个主要的参数：小分子与4CFH位点的结合能量，相关氨基酸残基以及氢键结合位点的氨基酸。PT1是AMPK的一个激活剂，在本实验中作为对接实验的阳性对照，被对接到4CFH位点。结果显示鼠尾草酸和PT1同样可以被对接到4CFH位点，且共享7 个残基，分别为：LYS 261、ASP 128、ARG 263、ILE 259、ARG 132、LYS 260、GLU 232；PT1、鼠尾草酸与4CFH的结合能量分别为－821.25 kJ/mol和－180.994 kJ/mol；氢键结合位点的氨基酸残基分别为ARG 263、ARG 132和GLU 232、ARG 132。这些结果表明鼠尾草酸与PT1以类似的方式结合到4CFH位点，因此鼠尾草酸和PT1可能有同样的生物活性，能激活AMPK蛋白的表达，这与细胞实验结果一致。

讨 论

本实验结果显示FFAs能显著增加细胞内TC、TG的含量，而鼠尾草酸能显著降低由FFAs增 加的TG、TC含量，这说明鼠尾草酸能降低细胞内TC、TG的水平从而降低细胞内脂肪的积累。 而Compound C处理细胞后，油红O染色结果表明，被鼠尾草酸降低的细胞内的脂肪含量以及细胞内的TC、TG水平均被显著增加（ P ＜0.05），这些结果表明鼠尾草酸降低脂肪积累和TC、TG含量的作用与AMPK密切相关。

为了进一步验证AMPK和鼠尾草酸的关系，本实验使用分子对接实验研究了AMPK和鼠尾草酸的相互作用。 分子对接经常被用于模拟小分子与大分子之前可能的结合位点以及结合方式。 PT1是AMPK的激活剂，在分子对接的研究中表明，PT1可以对接到AMPK的α亚基从而激活AMPK，更进一步在HeLa细胞研究中使用抗磷酸化AMPKα-Thr-172抗体进行蛋白免疫印记反应，结果显示PT1可以促进AMPK α亚基Thr-172的磷酸化。 而本实验研究表明鼠尾草酸与PT1小分子以类似的方式结合到AMPK蛋白，并且在细胞实验中表明鼠尾草酸能促进AMPK磷酸化蛋白的表达，从而调节脂肪代谢。 因此，鼠尾草酸与PT1小分子可能具有相似的作用机制，促进AMPKα亚基Thr-172的磷酸化。

综上所述，本实验研究发现鼠尾草酸一方面能激活AMPK磷酸化，从而抑制SREBP-1C、ACC、FAS、SREBP-2、HMGCR基因的表达，达到抑制TG、TC合成的目的；另一方面能促进PPARα、CPT1基因的表达，达到促进脂肪β氧化的作用，从而在抑制脂肪合成，促进脂肪氧化两个方面起到降低脂肪积累的作用。

本文《鼠尾草酸通过激活AMPK降低游离脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪积累》来源于《食品科学》2020年41卷11期171-178页，作者：程静，刘莹，刘垚杰，赵江，吉洋琳，刘东，王浩。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190602-002。

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