小麦抗白粉病基因Pm41

小麦白粉病是一种广泛发生的真菌性病害。培育抗病品种是白粉病严重发生地区重要的育种目标，发掘和克隆抗白粉病基因是实现这一目标的关键。野生二粒小麦 (Triticum dicoccoides, 2n = 4x = 28, AABB) 是普通六倍体小麦的祖先种，起源于中东“新月沃土”地区，经历了长期的自然演变，积累了丰富的遗传多样性，进化出多样化的抗白粉病基因，是小麦抗病育种珍贵的遗传资源。从野生二粒小麦中已经发掘出Pm16、Pm26、Pm30、Pm36、Pm41、Pm42和Pm64等7个抗白粉病基因，还有MlZec1、MlIW72、PmG16、Ml3D232、MlIW170、PmAs846、PmG3M、MlIW172和MlIW30等多个临时命名的基因。

为了发掘和克隆野生二粒小麦的抗白粉病基因，李根桥同学在中国农业大学小麦组攻读博士学位期间 (2006年9月-2009年6月)，发现野生二粒小麦品系IW2全生育期免疫或高抗白粉病(IT 0; -1, 图1)。IW2采自以色列Mount Hermon地区，是中国农业大学孙其信教授与以色列海法大学进化研究所Tzion Fahima教授和Eviatar Nevo教授执行中囯-以色列合作研究项目期间从以色列引进的野生二粒小麦。

图1 野生二粒小麦IW2和硬粒小麦Langdon及其杂种F1代对白粉病菌的反应(Li et al., 2020)

用高感白粉病的硬粒小麦品种Langdon(LDN，IT 4)与IW2配制遗传分离群体，利用白粉菌E09菌株接种F1、F2代和F2:3家系进行抗性遗传分析，发现IW2的白粉病抗性由显性单基因控制，后正式命名为Pm41。通过BSA分析发现，位于3BL染色体臂上的6个SSR标记Xwmc326、Xbarc77、Xbarc84、Xwmc687、Xgwm114和Xwmc236与Pm41基因连锁。利用中国春第三部分同源群的缺体-四体、双端体和缺失系将Pm41基因定位于3BL末端Bin 0.63-1.00染色体物理区间。进一步开发出与Pm41基因连锁的EST-STS标记BE489472、BE637789和BE517780，整合到遗传图谱，将Pm41基因定位于BE489472和XWMC687之间2.7cM的遗传区间(图2; Li et al., 2009)。

图2 抗白粉病基因Pm41分子标记定位(Li et al., 2009)

此后，王振忠同学在中国农业大学攻读博士学位期间(2010年9月-2015年6月)利用175个Langdon/IW2 F6代重组自交系群体对Pm41基因进一步定位。采用比较基因组学分析发现，Pm41位点基因组区域与二穗短柄草2号染色体、水稻1号染色体和高粱3号染色体同源区间存在良好的共线性关系，据此开发了19个多态性分子标记，加密了Pm41遗传连锁图谱，将其定位于XWGGC1505和XWGGC1507两个分子标记之间0.6 cM的遗传区间，并找到与Pm41共分离的分子标记XWGGC1506。该区间对应二穗短柄草11.7 kb、水稻19.2 kb和高粱24.9 kb的基因组区域(Wang et al., 2014)。

图3 抗白粉病基因Pm41比较基因组学定位(Wang et al., 2014)

后来，李淼淼同学在中国农业大学攻读博士学位(2014年9月-2018年6月)和在中国科学院遗传与发育生物学研究所进行博士后研究期间继续进行Pm41基因克隆工作。利用55个采自不同生态区的白粉菌菌株对IW2进行抗病性鉴定，发现其对其中的51个菌株(92.73%)表现抗性，说明Pm41的抗谱较广。BSR-Seq分析发现小麦3BL染色体上富集Pm41关联SNP最多，利用这些SNP序列和中国春3B染色体参考基因组序列，开发了8个与Pm41紧密连锁的多态性分子标记。利用2,448个Langdon/IW2 F2遗传作图群体，将Pm41基因定位于M171和M160两个分子标记之间0.08 cM的遗传区间，M78和M97分子标记与Pm41共分离(图4a)。对中国春3BL染色体参考基因组的Pm41基因定位区间进行基因注释分析发现，该区段包含4个蛋白质编码基因，但没有发现明显的抗病相关基因，推测野生二粒小麦IW2和普通小麦中国春在Pm41位点可能存在较大的序列变异。

图4 抗白粉病基因Pm41图位克隆(Li et al., 2020)

为了克隆Pm41基因，构建了IW2品系BAC文库，采用染色体登录和步移的策略构建了Pm41基因的物理图谱。IW2的BAC文库含有326,784个HindIII酶切位点BAC克隆，平均插入片段120 kb。首先利用与Pm41距离最近的紧密连锁或共分离分子标记M78、M97、M160和M171筛选BAC文库获得4组阳性BAC克隆。通过BAC测序和序列组装，利用阳性BAC克隆末端序列设计5个特异标记T1-T5继续筛选BAC文库。最终获得9个阳性BAC克隆构建的BAC跨叠群(图4)，BAC测序和序列拼接获得两个非重叠的contigs序列，IW2_ctg1 (140 kb) 和 IW2_ctg2 (350 kb)。两条contigs注释出6个蛋白质编码基因，其中包含一个抗病基因CNL，被作为Pm41的候选基因(图4)。此后，四倍体野生二粒小麦 “Zavitan”和硬粒小麦“Svevo”的参考基因组陆续释放，将Pm41位点基因组区域在IW2、Zavitan、Svevo和中国春中进行共线性分析，发现CNL/cnl基因仅存在于四倍体小麦3B染色体上，而在六倍体中国春中是缺失的(图5)。

图5Pm41基因组区段在小麦种间的比较(Li et al., 2020)

序列分析显示，与IW2中的CNLIW2相比，Zavitan、Svevo和LDN中的cnl等位基因在起始密码子ATG之前0.79 kb启动子区和3′ UTR区分别存在一个~8.6 kb mutator sub-class 插入缺失(InDel-1) 和~8.8 kb CACTA sub-class插入缺失(InDel-2)，此外在基因编码区也存在多处SNP差异(图4b)。基因表达分析显示，在接种白粉菌前后，抗病野生二粒小麦亲本IW2中的CNL均有表达(图5a)，并且明显受到病原菌的诱导(图5b)，而感病硬粒小麦亲本LDN的等位基因cnl不表达(图5a)。

图5 Pm41候选基因CNL的表达分析(Li et al., 2020)

为了验证CNL基因是否具有抗白粉病的功能，我们利用EMS诱变创制IW2感白粉病突变体。根据M2代和M3代苗期接种鉴定，获得7个高感白粉病的突变体家系。进一步对这7个感病突变体的CNL基因全长DNA序列进行序列分析，发现这些突变体在CNL基因上都发生了错义突变或无义突变(图4)。其中M73 (G302E)、M215 (P354L)和M88 (S434N)错义突变位于NBS保守结构域上，M163 (R885W)、M198 (L816F)和 M113 (G872D)错义突变位于LRR保守结构域上。M107 (Q650*)中位于LRR结构域的无义突变导致蛋白翻译提前终止(图6)。这些突变体证明CNL基因对于Pm41的白粉病抗性是必需的。

我们分别构建了玉米Ubiquitin启动子驱动CNL基因全长CDS的过表达载体和CNL基因自身启动子驱动的CNL基因组全长序列的表达载体，采用农杆菌介导遗传转化高感白粉病小麦品种Fielder。利用E09菌株接种T0代转基因植株和T1代家系，发现CNL基因的超量表达和自身启动子表达载体转基因阳性植株对E09菌株均表现高抗或免疫反应。基因表达分析显示T2过表达株系OECNL-5和互补转基因株系CNL-5 中的CNL转基因明显受到白粉菌诱导上调表达，进一步证明了CNL为抗白粉基因Pm41(图7)。

分析PM41蛋白在麦类植物和其他植物中的同源蛋白发现，PM41同源蛋白只存在于野生二粒小麦Zavitan(TRIDC3BG077810)、硬粒小麦Svevo (TRITD3Bv1G261150.1)和Kronos(scaffold_036708)、普通小麦 Claire (scaffold_083040)的3B染色体，以及大麦Morex(Horvu3Hr1G112930.1)的3H染色体上。而在乌拉尔图小麦(AA)、粗山羊草(DD)、野生二粒小麦、硬粒小麦和中国春的A和D亚基因组上均没有直系同源蛋白。聚类分析显示PM41蛋白在其他植物中也未有同源蛋白存在。

为了探明Pm41基因的地理分布和单倍型，我们开发了Pm41的功能标记WGGB427，分析了来自世界不同国家和地区的796份四倍体小麦和1122份普通小麦，只有8份(1.81%)野生二粒小麦品系(包括IW2)含有Pm41基因，进一步扩增基因全长序列发现其中5份材料的基因序列与Pm41完全一致，1份材料在第二个外显子上存在一处同义突变，1份材料在启动子区存在一处SNP。通过接种E09菌株发现，这些野生二粒小麦材料均表现免疫或高抗反应型。从地理分布上看，这8份野生二粒小麦均来自于以色列Mount Hermon及附近地区，与同样来源于野生二粒小麦的抗条锈病基因Yr15和Yr36的分布区域有部分重叠(图9; Klymiuk et al., 2019; Huang et al., 2016)。根据功能标记WGGB427的鉴定结果可将CNL基因划分为3种单倍型组(Hap-1、Hap-2和Hap-3)，其中Hap-1包括携带CNL基因的8份野生二粒小麦材料，Hap-2包括像LDN类型的728份四倍体小麦和726份普通小麦材料中的感病等位基因cnl，Hap-3包括如中国春类型的60份四倍体小麦和396份普通小麦材料，其中缺失了Pm41位点(null)。

图9 Pm41基因的分布(Klymiuk et al., 2019; Li et al., 2020)

小麦抗白粉病基因Pm41编码的CNL蛋白是首次从野生二粒小麦中克隆的抗白粉病蛋白。野生二粒小麦是普通小麦的直接祖先，根据地理分布可划分为南部居群和北部居群，现代生物学和考古学证据显示小麦的驯化主要发生在北部居群(包括土耳其东南部地区)。从地理分布看，Pm41基因主要存在于野生二粒小麦的南部居群，而野生二粒小麦的北部居群、栽培二粒小麦、硬粒小麦和普通小麦中均不含有该基因，说明Pm41基因与同样来源于野生二粒小麦南部居群的抗条锈病基因Yr15和Yr36类似，在进化出来后就被限制在其发源地周边的野生二粒小麦居群中，没有参与到小麦的驯化和多倍化过程。转基因实验显示，Pm41基因在普通小麦Fielder中仍然表现高抗或免疫白粉病，说明该基因可以作为一个尚未利用的优异抗白粉病基因资源用于现代小麦抗病育种中。

小麦抗白粉病基因Pm41(CNL)的克隆由中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇课题组、中国农业科学院作物科学研究所李洪杰课题组、中国农业大学、湖北省农业科学院植保土肥研究所、以色列海法大学和美国UC Davis等单位的研究人员合作完成。李根桥、王振忠、李淼淼、李贝贝等研究生同学先后参与了该项研究。研究结果2020年6月24日在线发表于New Phytologist杂志(Li et al., 2020)。

主要参考文献

1. Huang L, Sela H, Feng L, Chen Q, Krugman T, Yan J, Dubcovsky J, Fahima T. (2016) Distribution and haplotype diversity of WKS resistance genes in wild emmer wheat natural populations. Theoretical and Applied Genetics, 129: 921-934

2. Klymiuk V, Fatiukha A, Fahima T. (2019) Wheat tandem kinase provide insights on disease resistance gene flow and host-parasite co-evolution. Plant Journal, 98: 667-679

3. Li GQ, Fang TL, Zhang HT, Xie CJ, Li HJ, Yang TM, Nevo E，Fahima T, Sun QX, Liu ZY. (2009) Molecular identification of a new powdery mildew resistancegene Pm41 on chromosome 3BL derived from wild emmer (Triticum turgidum var. dicoccoides). Theoretical and Applied Genetics, 119: 531-539.

4. Li MM, Dong LL, Li BB, Wang ZZ, Xie JZ, Qiu D, Li YH, Shi WQ, Yang LJ, Wu QH, Chen YX, Lu P, Guo GH, Zhang HZ, Zhang PP, Zhu KY, Li YW, Zhang Y, Wang RG, Yuang CG, Liu W, Yu DZ, Luo MC, Fahima T, Nevo E, Li HJ, Liu ZY. (2020) A CNL protein in wild emmer wheat confers powdery mildew resistance. New Phytologist. DOI:10.1111/nph.16761
   

5. Wang ZZ, Cui Y, Chen YX, Zhang DY, Liang Y, Zhang D, Wu QH, Xie JZ, Ouyang SH, Li DL, Huang YL, Lu P, Wang GX, Yu MH, Zhou SH, Sun QX, Liu ZY. (2014) Comparative genetic mapping and genomic region collinearity analysis of the powdery mildew resistance gene Pm41. Theoretical and Applied Genetics, 127: 1741-1751