力证！心肌细胞不能再生？不，新证据被发现：可以被诱导再生

　　心力衰竭影响着全球2600多万人，因此寻找治疗心力衰竭的有效方法是一个主要的公共卫生目标。心力衰竭的一个主要潜在原因是成人心肌在受损后无法再生。尽管成年鼠和人类心脏的心肌细胞都具有有限的循环再生能力，但从再生角度来看，这种低的心肌生成率与治疗并没有多大关系。相比之下，哺乳动物在出生后的短时间内能够心肌再生，这是由已存在的心肌细胞增殖介导的。目前为止，已经报道了几个可以调控新生哺乳动物心肌细胞周期阻滞的调节因子，揭示了心肌细胞周期调控的复杂性。我们仍然需要更好地理解其复杂机制之间的相互作用。

　　其中Meis1是TALE家族的同源框转录因子，已被证实是心肌细胞周期的调节因子。Meis1的缺失延长了成年小鼠心肌细胞增殖的后窗期，激活了心肌细胞有丝分裂。然而，心肌细胞在Meis1缺失后的增殖是短暂的，最终发生细胞周期阻滞。事实上，尽管条件性敲除Meis1可以防止冠状动脉左前降支近端结扎术后左心室功能继续恶化，但与心肌梗死(MI)后即刻值相比，心功能几乎没有改善。因此，在Meis1敲除后，其他机制可能被激活。已有报道Meis1与一些调节细胞定位和转录活性的蛋白质有关；然而，它们在心肌细胞中的作用仍然未知。

　　来自于美国德州大学西南医学中心心脏病学系的HeshamA. Sadek团队在Nature 上发表了题目为“A calcineurin-Hoxb13 axis regulatesgrowth mode of mammalian cardiomyocytes”的研究论文，揭示了小鼠出生后心脏中Meis1表达和功能的调节因子—Hoxb13，并确定了其在调节心肌细胞周期中的作用。

　　该研究发现，在Hox家族中，Hoxb13是唯一与Meis1表达模式相似的转录因子。此外，近距离结扎试验(PLA)显示Hoxb13和Meis1在小鼠出生后7天(P7)的心肌细胞上具有相关性。

　　随后，作者采用心肌细胞Hoxb13特异性敲除鼠（Hoxb13-KO）观察了其新生小鼠的心肌细胞表型。与野生型小鼠相比，Hoxb13-KO鼠在心脏形态、心重体重比和左心室功能上没有差异，观察到单个心肌细胞横截面积(CSA)显著减少，磷酸化组蛋白H3-阳性(PH3+)有丝分裂的心肌细胞增加。这些现象只在P14的Hoxb13-KO心脏中被观察到，但在年龄更大的小鼠心脏上并没有被观察到。Hoxb13缺失导致的心肌细胞增殖的出生后窗口的延长并没不持续，这与Meis1缺失的表型相似。

　　为了研究Hoxb13缺失是否能诱导有丝分裂后心肌细胞重新进入细胞周期，研究者构建了他莫昔芬诱导的心肌细胞特异性Hoxb13敲除小鼠（Hoxb13-iKO）。在Hoxb13-iKO心脏中发现心肌细胞横截面积明显减小，PH3+和aurora B激酶阳性的心肌细胞也显著增加。胶原酶消化后的成年心肌细胞数量的定量显示Hoxb13-iKO心脏的心肌细胞数量显著增加。单核心肌细胞的比例也显著增加，多核心肌细胞的比例下降。此外，研究者使用了一个谱系追踪系统，将心肌细胞特异性的Myh6mERcremER和带有马赛克分析的双标记(MADM) 小鼠与Hoxb13fl/fl小鼠杂交，产生Hoxb13-iKO MADM 鼠以检测心肌细胞的分裂。对单个绿色或红色心肌细胞的评估证实，Hoxb13的缺失导致新生的心肌细胞增加两倍。以上证据表明心肌细胞特异性缺失Hoxb13在成人心脏中诱导大量的心肌细胞有丝分裂。

　　其次，为了确定缺失Hoxb13是否会诱导有意义的心肌细胞再生，研究者构建了心肌梗死模型。超声心动图结果显示在心肌梗死后8-16周，Hoxb13-KO心脏的左心室射血分数(LVEF)明显高于对照组。其他参数，如心重体重比，湿干肺比率或疤痕形成均没有明显的变化。然而，随着时间的推移，与损伤后即刻值相比，缺失Hoxb13并没有改善心肌梗死患者左心室收缩功能。总之，这些研究结果表明Hoxb13的缺失可以防止心肌梗死后收缩功能的逐渐恶化，但不能诱导实质性的功能恢复。

　　再接下来，研究者使用了心肌细胞特异性Meis1-Hoxb13双敲除小鼠(以下称DKO)，以检测小鼠P28的心肌细胞增殖情况。Meis1-KO和Hoxb13-KO小鼠此时没有明显的心肌细胞分裂。DKO小鼠的PH3 +和aurora B kinase阳性心肌细胞显著增加，同时观察到一些心肌细胞处于肌节松散状态，特点是条纹和肌节定位于心肌细胞的边缘。这是新生心脏心肌细胞增殖的一个标志，在成年心脏中很少见，即使有丝分裂存在时也不常见。此外，尽管六个月大的DKO小鼠的心肌细胞CSA仍显著变小，但LVEF仍与对照组相似。

　　再次，研究者探究了Meis1和Hoxb13双敲除成年小鼠(DiKO)是否可以促进心肌细胞重新进入细胞周期。两种基因的诱导缺失均未改变心脏形态学或纤维化水平。然而，心重体重比增加；在注射他莫西芬后一周DiKO心脏也显示心肌细胞CSA减少约30%。在此时间点，具有松散肌节的心室心肌细胞数量也显著增加。心肌细胞有丝分裂和胞质分裂的细胞数量在DiKO心脏敲除后一周也明显增加，而且DiKO心脏心肌细胞总数量显著增加。

　　为了检测是否心肌细胞增殖的增加会在成年心脏中间接引起心脏修复，在MI两周后，在DKO小鼠心脏中发现细胞周期抑制子p21和p15/16蛋白显著降低。梗死的DiKO心脏有较小的纤维化疤痕，心肌梗死后16周的心脏重量/体重和绝对心脏重量值低于对照组，虽然在心肌梗死后一周LVEF有所下降，但从第4周开始，DiKO小鼠的LVEF逐渐显著改善。与这些结果一致的是，心肌梗死后16周的磁共振成像(MRI)显示LVEF、卒中体积和心输出量显著升高。这些结果表明，Meis1和Hoxb13缺失后诱导心肌细胞增殖可以改善心肌梗死后左室收缩功能。

　　随着出生后增殖能力的丧失，心肌细胞转向肥厚性生长。钙调神经磷酸酶(calcineurin)依赖信号被认为是肥厚生长的基本介质。因此，研究者检测了出生后小鼠心脏内calcineurin丰度的变化。CnA、Meis1和Hoxb13抗体共沉淀显示，这三种蛋白在出生后心脏内相互作用。为了确定CnA在Hoxb13中是否直接相互作用，对CnA His6进行了体外下拉实验，将谷胱甘肽s -转移酶(GST)融合到一个包含ITIWFQ序列的16个氨基酸肽，或在这一假定基序中包含丙氨酸取代物的突变肽。结果显示，CnA与GST Hoxb13肽共纯化，但突变形式却没有此现象，表明Hoxb13的PxIxIT位点介导两者的相互作用，并证明了Hoxb13 S204位点被calcineurin去磷酸化，促进Hoxb13的核转位，促进细胞周期阻滞。

　　在P2时，calcineurin转基因小鼠（CnA-Tg）心脏含有的PH3+心肌细胞明显减少；相反，与野生型相比，calcineurin内源性抑制剂Rcan转基因小鼠（Rcan1-Tg）心脏在P21时有更多的PH3+心肌细胞。研究者进行了P1心尖切除术，检测了CnA-Tg心脏的再生能力。21天后，与对照组相比，CnA-Tg心脏显示出明显的LVEF下降，并有明显的疤痕。此外，与野生型心脏相似，CnA-Tg/Rcan1-Tg双转基因的心脏在P21完全恢复。在心肌梗死后一周，Rcan1过表达抑制了CnA活性的小鼠的心脏心肌细胞增殖显著增加，两个月后心功能显著恢复。总之，calcineurin调控了心肌细胞增殖。

　　启发与问题：

　　1.通过钙调神经磷酸酶信号的通量在出生后心脏负荷增加和哺乳动物心脏再生能力抑制之间提供了一个协调的联系，并确定Hoxb13是心肌细胞分化和增殖的重要调控因子。

　　2.本研究中概述的Meis1 Hoxb13 DKO心肌细胞有丝分裂表型，有力证明了心肌细胞向不成熟状态的逆转是可行的，这一途径可能是治疗干预心肌细胞再生的可行目标。

　　3.Calcineurin是一种Ca2+_钙调蛋白激活的磷酸酶，由于其在一系列生物功能中发挥的作用而被广泛研究，包括心肌肥厚。许多研究集中于Calcineurin通过活化T细胞转录因子家族的核因子（(NFAT)）激活转录的能力。虽然大多数研究关注Calcineurin在病理性肥厚重构中的作用，但有大量证据表明，它参与了正常的出生后心脏生长以及生理上的肥厚。该研究结果表明Meis1和Hoxb13参与了病理和生理心肌细胞肥大的诱导，以及Calcineurin下游的心肌细胞周期，突出了Calcineurin在出生后心脏心肌细胞成熟中的复杂作用。提示我们在做研究时不可过于追逐热点，要全面认识一个分子，也许会有新的发现。

　　4.考虑到DKO心脏始终细胞体积较小，作者进行了进一步的研究，以评估敲除Meis1和Hoxb13对心肌细胞肥大的影响。通过主动脉缩窄(TAC)构建心肌肥厚模型，DKO对病理性肥厚的反应变弱，而且DKO心脏表现出一种运动诱导的降低的生理肥厚反应。这是很好的阳性结果，但作者没有深入探索。DKO小鼠在心肌肥厚的作用机制仍需要进一步研究。

　　5.研究者利用了多种工具鼠，包括特异性心脏敲除小鼠、基因过表达小鼠.同时构建了多种病理模型，MI,TAC，心尖切除术等，来佐证自己的观点，提供了有力的载体实验证据。此外，研究思路清晰，逻辑严谨，值得借鉴。

　　参考消息：

　　https://www.nature.com/articles/s41586-020-2228-6