“艾”学习丨RNA甲基化修饰系列

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嗨~大家周六好呀

小艾又来啦

今天小艾给大家推荐“艾”学习的主题是

RNA甲基化修饰

当当当当~

那么接下来

照例是关于RNA甲基化修饰的相关小知识点

希望会对大家有所帮助哦

1

m6A抗体

m6A（N6-腺苷酸甲基化）是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化形式，作为真核生物RNA最常见的一种RNA转录后修饰，其导致了超过80%的RNA碱基甲基化。

不仅在各种物种可以观察到这种RNA修饰，它也广泛的参与到各种生理过程中，包括调节干细胞分化、DNA损伤修复、脂肪分化、学习记忆、癌症进程、生长发育和免疫等。在免疫反应中，m6A也被证明参与了宿主和病毒间的交流。

小艾这边推荐Epigentek品牌的全能型m6A抗体 cat# A-1801：

适用种属：小鼠、人及其他种属

免疫原：KLH偶联m6A

应用类型：DB, ELISA, ICC, IP, MeRIP, NucleotideArray

2

m6A Elisa定量检测（比色法）

目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS），具体方法包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、SCARLET、LC-MS/MS等。高通量测序偏向单碱基水平鉴定m6A；而比色法与LC-MS/MS比较相似，也是从整体水平上检测RNA上m6A甲基化水平，但是相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。

小艾这边推荐Epigentek公司的EpiQuik M6A RNA Methylation Quantification Kit试剂盒（cat#P-9005）：

特点和优势：类似于Elisa步骤的比色法检测方法方便快速，整个操作步骤可在3小时45分钟内完成；高灵敏，检测的最低下限低至10pg的m6A；独特的结合液容许>70 ngt 的RNA紧紧的结合在孔板上，可以定量检测来自mRNA和ncRNA，如：tRNA，rRNA和snRNA；优化的抗体和增强剂溶液可以特异的定量检测m6A，不会产生交叉反应；对于来自任何种属的m6A都可以实现定量检测；48/96可拆卸微孔板设计

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如何进行尿液m6A分析

尿液中m6A水平会伴随着身体DNA/RNA的m6A失调，或细胞内DNA/RNA m6A状态的改变而改变。许多研究表明，尿液中排出的m6A有可能成为癌症生物标志物。

例如，在具有活动性疾病状态的结肠直肠癌患者的尿液中，有高水平的m6A。小艾这边推荐Epigentek品牌全新推出的尿液m6A分析试剂盒cat#P-9015：

特点与优势：创新的实验方法，操作简便，4小时内完成实验；可拆卸式96孔条孔，使用灵活，亦适用于高通量分析；优化的试剂盒配方体系，背景信号低，结果准确，可靠，一致；检测结果与HPLC方法检测结果相当；尿液需求小，每次反应仅需5ul尿样；对m6A具有极高特异性，对于未甲基化的腺苷无交叉反应

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m6A甲基化酶活性测定

甲基化转移酶（methyltransferase）也叫Writers，是一类重要的催化酶，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。

这些蛋白并不是各自孤立的，而是会形成复合物（complex）共同行使催化功能。由于酵母和线虫等生物缺少这四种核心蛋白中的一种或几种，所以m6A甲基化修饰属于高等真核生物独有的碱基修饰反应。

小艾这边推荐Epigentek品牌的m6A甲基化酶活性/抑制分析试剂盒（cat#P-9019）:

特点与优势：类似于Elisa步骤的比色法检测方便快速，整个操作步骤可在4小时完成；背景信号极低，检测方法简单，准确，稳定；适用于细胞/组织的核蛋白提取物以及纯化的蛋白质，从而可以检测m6A甲基化转移酶抑制剂的抑制效果；灵敏度高，可以从低至2g的核提取物或50ng的纯化酶中检测到活性；试剂盒中有标准品，可以对m6A甲基化酶的比活进行定量

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m6A去甲基酶活性测定

m6A这种甲基化修饰被证明是可逆化的，包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等共同参与。其中去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。

小艾这边推荐Epigentek品牌的m6A去甲基化酶活性/抑制分析试剂盒（cat#P-9013）:

优势与特点：比色法，便于操作，速度快，5小时完成；背景信号极低；从细胞/组织核提取物和纯化蛋白中检测m6A去甲基化酶抑制剂在体内或体外的抑制效果；高灵敏度，能从低至2μg核提取物或者50ng纯化酶中检测酶活性；包含标准品，能对m6A去甲基化酶的活性定量测定；条形微孔板，适用于手动或高通量分析

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m6A RNA免疫共沉淀(meRIP)

甲基化RNA免疫共沉淀 (methylated rna immunoprecipitation，meRIP)基于抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀达到富集甲基化修饰片段的目的。

小艾这边推荐Epigentek品牌的CUT&RUN RNA m6A富集纯化试剂盒cat# P-9018，在反应过程中，磁珠-m6A抗体可以特异性识别RNA的m6A甲基化修饰位点，在RNA裂解酶的作用下，m6A的靶序列两端的RNA序列被裂解，而与m6A抗体结合的m6ARNA区域则不受影响，目的片段进一步通过释放、纯化和洗脱，最终实现m6A RNA的富集。

特点与优势：富集效果好：在RNA裂解酶和m6A抗体的共同作用下，在RNA序列裂解的同时，确保与抗体特异性结合的m6A区域序列不受影响，从而实现短片段m6ARNA的有效富集；只需微量样本起始量：≥500ngRNA；低背景：由于m6A甲基化位点邻近序列被消化裂解，极大的降低了序列背景；操作快速&简单，＜3h完成

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m6A RNA免疫沉淀-测序文库构建(m6A-seq)

甲基化rna免疫共沉淀结合高通量测序 (methylated rna immunoprecipitation sequening，merip-seq)技术，可以对rna转录后甲基化修饰图谱进行全面研究，是表观转录组学研究的关键技术。

小艾这边推荐Epigentek品牌的CUT&RUN RNA m6A-Seq试剂盒cat#P-9016，其原理是通过m6A特异性抗体对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段进行高通量测序。

特点与优势：富集效果好：在RNA裂解酶和m6A抗体的共同作用下，在RNA序列裂解的同时，确保与抗体特异性结合的m6A区域序列不受影响，从而实现短片段m6ARNA的有效富集；只需微量样本起始量：≥500ngRNA；低背景：由于m6A甲基化位点邻近序列被消化裂解，极大的降低了序列背景；从RNA到cDNA文库构建不到6h即可完成