Food Chemistry：一种从加工肉制品中提取DNA的新型试纸装置

Introduction

近年来，肉类掺假已成为肉制品加工企业经营者和消费者日益关注的问题。鉴于种种原因（包括过敏原管理和消费者选择），成分认证十分重要。消费者对掺假加工肉制品的消费越来越谨慎。此外，为了低成本，加工牛肉产品通常掺入猪肉或鸡肉。为了限制肉类掺假，构建可靠且准确的方法来鉴定掺假肉样品的需求越来越迫切。

最近，包括基于DNA的分析、蛋白质分析和脂肪基质分析在内的几种方法已被有效地应用于肉类品种鉴定。在这些方法中，基于DNA的分析因其热稳定性、高灵敏度和特异性而被广泛使用。已经开发了几种从肉类样品中提取DNA的方法。然而，这些方法耗时、昂贵并且加工肉制品中的核酸回收率低。因此，针对复杂肉类样品，有必要开发廉价、简单、快速和准确提取DNA的方法。

在这项研究中，韩国光州科学技术院理化学院化学系的Bhagwan S. Batule、Youngung Seok和Min-Gon Kim*设计了一种简单快速的线粒体基因组DNA（mtDNA）提取装置。此外，使用基于实时PCR的肉类样品检测系统分析了提取的mtDNA。通过使用肉类样品混合物进行对该方法进行了验证，并使用5 种商业加工肉制品（例如香肠、肉饼、肉丸和鸡块）进行标记和定量验证。

图1. 手持DNA提取装置快速提取肉制品中mtDNA示意图

Results and discussion

肉类特异性引物的可行性研究

物种特异性引物对的选择在实时定量PCR（qPCR）分析中非常重要。因此，我们筛选了3 种不同物种（猪肉、鸡肉和牛肉）的引物，并选择了3 个独特的引物对。在这项研究中，由于单细胞的高拷贝数，我们采用mtDNA而非基因组DNA。在这项工作中，我们通过简单的mtDNA提取和实时定量PCR结合开发了一种检测方法。

图2. 猪肉、鸡肉、牛肉等肉类样品实时检测的可行性研究

首先，我们通过实时定量PCR（图2）和琼脂糖凝胶分析（图S1）成功地验证了引物，以选择性鉴定每种肉类样品（猪肉、鸡肉和牛肉）。根据图2中的扩增曲线，我们能够区分每种肉类样品。此外，我们通过直接提取、QIAgen试剂盒提取和手持式提取装置提取进行了猪肉样品mtDNA的比较研究

图3. 直接提取、QIAgen试剂盒提取和手持式mtDNA提取装置提取的样品DNA扩增效率比较

我们发现用手持装置提取的mtDNA与使用 QIAgen 试剂盒提取的 DNA 显示出相似的结果（图 3A 和 3B ），表明装置的适用性。对加工肉制品进行直接 PCR 检测无法产生任何扩增曲线，这表明它可能包含 PCR 抑制剂，例如盐和蛋白质（图 3A 和 3B ）。使用我们推出的 mtDNA 提取装置可以在 5 分钟内完成 mtDNA 的提取，而 QIAgen DNA 提取需要 30 分钟以上。基于试纸的 mtDNA 提取方法以合理的 mtDNA 提取效率帮助去除了加工肉制品中存在的 DNA 聚合酶抑制剂。因此，将基于试纸的 mtDNA 提取装置与核酸扩增方法结合是一个很好的机会。

拟定研究的灵敏性

图4. 对猪肉(A和B)、鸡肉(C和D)、牛肉(E和F)样品进行实时PCR检测

首先，准备了不同浓度的稀释肉类样品（0.1 ～ 100％）。随后，用试纸DNA提取装置提取mtDNA。从猪肉、鸡肉和牛肉中提取的mtDNA通过实时定量PCR成功扩增（图4A，4C和4E）。不同稀释度的肉类样品PCR扩增结果的Cq值对标准曲线显示出良好的相关系数，分别为1.00、0.98和0.97（图4B、4D和4F）。这些结果表明，所提出的方法可用于鉴定加工食品中肉的种类。我们相信，使用此装置提取的mtDNA可以通过核酸扩增方法用于肉类样品的灵敏性和选择性检测。

不同成分肉类样品的选择性研究

图5. (A)从猪肉、鸡肉和牛肉的不同组合中识别肉类类型图示；(B)各种肉类混合物的组合列表。

此外，我们调查了此检测方法的特异性。首先，我们从猪肉、鸡肉和牛肉的模拟掺假肉类样品的实验用二分体 生肉混合物中提取了mtDNA，如图 5A 和 5B 所示。随后，使用 qPCR 扩增分析每个样品。如图 5A 所示，成功筛选了低至 1 ％的肉类样品（猪肉、鸡肉或牛肉）与其他肉样品的组合。

用该方法检测商业肉制品

为了确认标签的可靠性，我们从超市购买了不同的商业加工肉制品，其中包含猪肉、鸡肉和牛肉等典型肉类。成功筛选和定量了肉的类型及肉制品（如香肠、肉排、鸡块、牛肉丸和热狗）上标明的百分比。从选定的加工食品中，未发现任何掺假样品，这表明本研究中使用的肉类样品均与其标签一致。因此，我们提出的方法为鉴别加工肉制品中的肉类掺假提供了良好的手段。

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Conclusions

在这项研究中，此即用型mtDNA提取装置已成功在5 分钟内提取了mtDNA。建立了一种简单、经济高效、环境友好、灵敏且特异的检测方法，以识别各种肉类。成功实现了0.1～100％的动态检测范围和高相关系数的不同肉类样品的检测，例如猪肉、鸡肉和牛肉。此外，从模拟掺假肉类样品中选择性地检测出不同的肉类型。最后，通过确定难以直观评估的市售加工食品中肉类的真伪，检测了此方法的适用性。因此，基于此手持式装置的mtDNA提取和肉类类型识别可用于评估肉类加工中的肉类掺假，并可用作现场肉类分析系统。

An innovative paper-based device for DNA extraction from processed meat products

Bhagwan S. Batule1, Youngung Seok1, Min-Gon Kim

Department of Chemistry, School of Physics and Chemistry, Gwangju Institute of Science and Technology, 261 Cheomdan-gwagiro, Gwangju 500-712, Republic of Korea

Abstract

Detection of food adulteration is a challenge. However, the identification of adulterated meat in processed products is important for health and personal preference. Mitochondrial genomic DNA (mtDNA) is a good candidate for reliable identification of meat ingredients; however, the extraction of mtDNA from processed products is a bottleneck for development of detection strategies. Therefore, we constructed a rapid (~5 min) mtDNA extraction device. mtDNAs from different meat samples, such as pork (Sus scrofa), chicken (Gallus gallus), and beef (Bos taurus), were successfully detected in up to 0.1% adulterated animal species. We believe that the proposed strategy could be applied to detect animal species from processed meat products to reduce fraudulent practices.

该文章《An innovative paper-based device for DNA extraction from processed meat products》将于《Food Chemistry》2020年8月出版。

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