Science亮点 | 活细胞、组织和动物中功能性材料基因靶向化学组装

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多细胞生物系统（比如大脑内的神经网络）的结构和功能的复杂性远远超出了人类现代技术能够实现的设计与组装能力的范畴。如果我们可以招募活体中的细胞来合成材料以及构建结构，则我们可以直接利用生物体自身的细胞组织结构作为模版，并利用生物学的原理来实现复杂的功能结构结构的自组织，完美地和生物体自身的解剖结构相结合。

2020年3月20日，斯坦福的鲍哲南和Karl Deisseroth教授（哈佛大学助理教授刘嘉、斯坦福大学Yoon Seok Kim、Claire E. Richardson、Ariane Tom为共同一作）在Science上发表了文章Genetically targeted chemical assembly of functional materials in living cells, tissues, and animals。在这篇文章中，研究人员通过利用酶靶向技术和高分子化学（基因靶向的化学组装法），实现了在特定基因为标靶的神经元的细胞膜上特定合成具有电活性的功能高分子。经过电生理和行为学分析，该功能高分子的基因靶向组装不仅不影响神经元的生存能力，不损伤其天然功能，还能够重塑膜特性和调节特定细胞的行为。该文章为在生物活体系统中构建各种具有基因靶向性的复杂功能性结构与材料提出了全新的思路和方法。

生命系统的复杂性源于细胞的复杂结构与功能。比如神经系统中就包含大量的结构和功能复杂的神经元细胞具有多种基因型和连接形式。因此，研究人员提出一个构想：即是否可以利用生物系统中的具有特定基因表型的细胞，构建出不同形式和功能的电子材料和器件。之前的研究表明，将微型电子元件结合到质膜上可以直接改变细胞活性，或者在活体组织中通过电化学聚合进而直接合成导电高分子可以降低细胞周围组织电化学阻抗。可惜的是，这些方法均不具备细胞类型的选择性。

为了实现在活体动物中的指定基因类型的细胞上实现电化学活性高分子的合成，首先，研究人员选择了聚苯胺（PANI）和聚（3,4-乙撑二氧噻吩）（PEDOT）两种导电高分子，因为它们被广泛用于溶液相的合成以及他们的电子和离子的双重导电性能够非常有效的降低局部电化学阻抗。研究人员设计了一种基于化学修饰（图1A）的单酶促聚合反应，该聚合反应由表达于特定基因型的细胞中的酶引发聚合具有电学活性的导电高分子。具体步骤如下：1）灌注小分子导电高分子前体到生物体内，使其通过组织扩散到整个组织。2）酶催化下的氧化自由基阳离子聚合。由于自由基阳离子在水溶液中的扩散长度短且所得高分子的溶解度低，因此合成的导电高分子会沉积在近膜位置的靶细胞上。

研究人员利用过氧化氢酶Apex2作为酶引发剂。在之前的报道中，过氧化物酶可以在非常极端的条件下催化导电高分子的聚合。常用的条件为：高浓度的过氧化氢（> 1 mM），低pH值（pH = 1至5）以及高单体浓度（> 10 mM）。但是需要能够在中性pH值及生物相容的条件下进行材料聚合以保证细胞的活性。因此，研究人员首先在鼠海马神经元表达了人源的抗坏血酸过氧化物酶Apex2，并将其与黄色荧光蛋白结合以追踪位置（图1A）。其次，研究人员选择苯胺作为低氧化电位的单体，但是Apex2并不能在PBS中聚合苯胺单体，所以加入了苯胺二聚体进一步降低其氧化电位，我们将苯胺单体-二聚体混合物（0.5 mM，1：1摩尔比）（图1B）添加到了0.1 mM H2O2的水溶液中用于培养固定的神经元。荧光和明场图像证实，Apex2（+）神经元显示黑色反应产物（图1D）。

图1 细胞中功能材料的基因靶向化学组装。（A）基于酶/ H2O2催化的大脑功能化聚合。蓝色表示非酶靶向细胞。（B）Apex2介导的聚合反应。标签1至5分别显示了N-苯二胺（苯胺二聚体，1），苯胺二聚体自由基阳离子（2），苯胺单体（3），苯胺三聚体自由基阳离子（4）和聚苯胺（PANI，5）的化学结构。（C）Apex2介导的聚合和PANI在靶细胞上的沉积的示意图。（D）原位遗传靶向合成和掺入导电高分子。图片为大鼠海马神经元的荧光（YFP）和明场图像。箭头指示单个神经元。

为了测试这些沉积物是否由聚苯胺（PANI）组成，研究人员使用了紫外线-可见-近红外（UV-vis-NIR）吸收光谱测试，在与以前报道的聚苯胺光谱结果比较（图2A）后，得到结论：Apex2（+）/ PANI的吸收峰波长更短，证明其合成聚苯胺但是合成的高分子分子量较低。然后，研究人员用100 mM对甲苯磺酸（Apex2（+）/ dPANI）处理聚苯胺固定的神经元，使其电导率增加并观察到紫外线-可见-近红外光谱的红移（图2A），结果与掺杂预期一致。对于Apex2（–）/ PANI，Apex2（+）/ PANI和Apex2（+）/ dPANI神经元，研究人员观察到与预期一致的颜色变化（图S4A）。紫外线-可见-近红外光谱显示掺杂的聚苯胺在615 nm处出现红移峰（图2C）。X射线光电子能谱（XPS）仅在Apex2（+）/ dPANI神经元中显示增强的S元素信号，证实了对甲苯磺酸的掺入。X射线近边缘吸收结构（NEXAFS），识别出胺和亚胺中不同的C–N或C = N特征，表明了沉积材料的化学成分。

变压扫描电子显微镜（VP-SEM）成像提供了神经元反应前后电导率的定性比较（图2，D至G）。Apex2（+）/ PANI神经元表现了更高的对比度，与外层导电性更高的结果相吻合（图2F）。同时酸性掺杂也进一步增强了对比度（图2G）。并且可以直接观察到体细胞和神经突，这表明掺杂PANI的表面电导率显著提高（图2，H和I）。此外，透射电子显微镜（TEM）同样证实了高分子在神经元膜上的沉积。

通过将金电极沉积到自然风干的固定神经元上，研究人员进一步研究了其电学性质（图2，J至L）。研究人员假设电极之间的导电成分仅来源于神经元上的导电高分子。为了防止在溶液掺杂过程中金电极和高分子之间发生分层，使用了HCl蒸气对高分子进行掺杂。如预期一致，Apex2（+）/ dPANI具有最低的电阻（图2，M和N）。随后，研究人员又测试了其他高分子，包括poly(3,4-ethylenedioxythiophene/PEDOT)，sodium 4-((5,7-di(thiophen-2-yl)-2,3-dihydrothieno[3,4-b][1,4]dioxin-2-yl)methoxy)butane-1-sulfonate (termed TETs) 以及非导电高分子poly(3,3′-diaminobenzidine) (PDAB)。Apex2（+）/ PANI-PTETs神经元的电导率高于Apex2（-）/ PANI-PTETs神经元，而Apex2（+）/ PDAB的电导率与Apex2（-）/ PDAB相比没有变化。为了进一步验证其电导率，研究人员在电导率测量的载片中培养人类肾脏293T细胞,与Apex2（-）/ PANI对照相比，没有酸掺杂的Apex2（+）/ PANI电阻降低了约两个数量级。随后，研究了人类皮质球体（human cortical spheroids， hCS）中的Apex2催化的聚合反应，hCS是人类干细胞衍生的三维类器官。在Apex2（+）/ PANI hCS经过反应处理30min后，在与YFP信号对应的位置上出现了着色和颗粒沉积（图S11，B至E）。在另一种三维制备得脑切片中，经过30分钟和60分钟的反应后，黑色反应产物的可视深度分别为60 μm和110 μm。

图2 导电高分子的化学和电学表征。（A）通过酸处理将聚苯胺（红色）转化为掺杂的聚苯胺（dPANI，绿色）结构。（B）归一化的UV-vis-NIR光谱。纯聚苯胺，紫色；Apex2（–）神经元：黑色；Apex2（–）/ PANI神经元：蓝色；Apex2（+）/ PANI神经元：红色。箭头指示吸收峰。（C）对甲苯磺酸处理前后Apex2（–）/ PANI和Apex2（+）/ PANI的UV-vis-NIR光谱。虚线箭头指示紫外可见吸收峰从574到615 nm红移。（D到I）SEM图像。（D）未反应的野生型，（E）Apex2（–）/ PANI，（F）Apex2（+）/ PANI和（G）Apex2（+）/ dPANI神经元。（G）和（H）的放大图像显示了高分子沉积。（J）具有PANI神经元的（蓝色）电接口示意图，用于电导率测量。酸掺杂（绿色）用于测试沉积的导电高分子的存在。（K和L）基于金电极玻璃基板的神经元明场图像，用于电流-电压（I-V）测量。（M和N）代表性IV曲线（M）和电阻变化总结（N）。HCl溶液的蒸发可能导致了 Apex2（–）/ dPANI样品的减少。

研究人员进一步探索了该方法在生命系统中的应用。神经元在苯胺及其二聚体的0.05 mM H2O2中仍保持活性，该反应条件足以使高分子沉积。在活体小鼠中，相同的反应条件在数周内未引起反应性胶质增生。在聚苯胺或PDAB聚合得前后，研究人员还在Apex2（+）-和Apex2（-）培养的大鼠海马神经元中实施了全细胞膜片钳技术。在聚合前后，Apex2（+）/ PDAB神经元中的注入触发巨大的动作电位，电容减小，并增加了跨膜电荷的分布距离。相比之下，随电容量增加，Apex2（+）/ PANI神经元动作电位降低，该结果与之前报道的将导电高分子引入而产生的电容效应一致。

为了对聚合前后的相同细胞进行严格的测试，研究人员还从急性脑切片中进行记录（图3A），在整个聚合反应过程中，对同一个细胞保持在全细胞膜片钳的测量模式中，以期待测量单一细胞反应前-后的电生理活性。结果证明，在导电高分子聚苯胺反应后，神经元的电容增加。而在非导电的PDAB反应后，神经元的电容降低（图3，C和E）。在所有条件中，而其它的细胞膜特性的变动均很小并且细胞在输入电阻和静息电位方面均表现良好。随后，研究人员对神经元的动作电位进行探究（图3，D和F）。反应后，对照组Apex2（–）神经元的放电频率没有变化，Apex2（+）/ PANI神经元由电流注入诱发的尖峰放电频次减少，而Apex2（+）/ PDAB神经元的尖峰放电频次增加（图3，D和F）。实验和理论研究均表明，神经元的尖峰放电与电容之间存在反相关关系，这与膜片钳结果相吻合，导电高分子沉积在活神经元的介电脂质双层上后，电容增加，绝缘性高分子沉积后，电容降低（图3，C和E）。这一结果显示可以通过导电/绝缘高分子在神经元上的聚合，实现具有基因选择性的，双向的改变神经元的可激发性。

图3 电生理学表征。大脑切片中的导电高分子。浅蓝色，反应前；紫色，在聚苯胺之后；深蓝色，在PDAB之后。（A）切片生理的工作流程。（B）聚合反应后脑切片的显微照片。箭头指示Apex2病毒的注射位点；虚线表示海马体。（C）聚苯胺聚合前后的膜电容和（D）注入电流引起的尖峰; 在反应前后的所有时间内，所有细胞均保持全细胞膜片钳配置，以进行直接的比较。将此处以及（E）和（F）中的所有后置条件归一化为相应的比较条件；平均电容值为20至45 pF。（E）在PDAB聚合前后，膜电容和（F）注入电流引起的尖峰。

最后，基于在动物体内基因靶向组装的电活性高分子，研究人员测试了自由运动的蠕虫的行为。研究人员在蠕虫（秀丽隐杆线虫）咽肌细胞的膜上表达了Apex2-绿色荧光蛋白（GFP）（图4，A和B），并观察到了显著的局部聚合反应（图4，C和D）。此时，Apex2（+）/ PANI蠕虫的咽肌抽动频率降低（图4E），结果与培养的神经元和脑片电生理学中观察到的靶向细胞抑制作用一致，但其它身体运动（例如弯曲）却没有明显的定量变化（图4E， 4F）。液态原子力显微镜显示聚合前后细胞膜的杨氏模量没有显著变化，而蠕虫的生存能力实验证实了聚苯胺具有良好的长期生物相容性。

随后，研究人员在GABA抑制性或者胆碱能兴奋性运动神经元中分别表达Apex2-GFP（图4，G至I ）。在导电高分子聚合后（图4J），兴奋→Apex2（+）/ PANI蠕虫显示出正弦正向运动受损，这与光遗传学上抑制蠕虫兴奋性神经元的结果一致。Apex2（–）/ PANI中的正弦前向运动和抑制→Apex2（+）/ PANI均不受影响。另一方面，与Apex（–）/ PANI蠕虫相比，抑制→Apex2（+）/ PANI蠕虫的逆转频率增加，转弯急剧增加（<90°）。这与抑制性神经元的光遗传学操纵的结果一致。抑制→Apex2（+）/ PANI蠕虫在振幅不变和波长减小的正弦波中前进的能力，但当抑制性神经元被烧蚀后，正弦波的振幅大大降低。与此模式相同，兴奋→Apex2（+）/ PANI蠕虫对乙酰胆碱酯酶抑制剂涕灭威（aldicarb）产生了抗药性，表明该处理降低了乙酰胆碱的释放，同时抑制→Apex2（+）/ PANI和Apex2（–）/ PANI蠕虫未观察到此现象（图4K）。此外，与兴奋→Apex2（+）/ PANI相比， 兴奋→Apex2（+）/ PDAB对涕灭威的抗药性降低（图4，L和M），在活体动物中，与导电高分子组装相比，绝缘高分子的胆碱能活性组装获得相反的作用与功能，两者结果均与电生理学一致。这一系列实验结果证明，可以在生物体内，增加或者降低特定基因型的细胞，来实现具有基因和细胞选择性的生物体行为上的重塑。

图4 秀丽隐杆蠕虫的细胞特异性聚合。（A）靶向聚合至蠕虫咽肌的示意图。（B）明场（左）和荧光图像（右），表达Pmyo-2 :: Apex2 :: mcd8 :: gfp的Apex2（+）与野生型Apex2（-）的对比。箭头指示GFP标记的咽肌和Apex2表达。（C）PANI反应中Apex2（+）蠕虫咽肌的明场时程图像。箭头指示咽肌和表皮之间的Apex2（+）黑色反应产物增加。（D）反应后Apex2（–）与Apex2（+）的亮度变化。（E）Apex2（–）/ PANI，Apex2（+）/ H2O2对照和Apex2（+）/聚合的身体弯曲率和（F）咽吸率。（G）运动神经元测试示意图。（H）GABA能（抑制）神经元[抑制→Apex2（+）]或胆碱能（兴奋）神经元[兴奋→Apex2（+）]的细胞类型特异性聚合。黑线表示特定于细胞类型的高分子。（I）分别在Punc-47或Punc-17启动子下表达Apex2 :: mcd8 :: gfp的抑制性→Apex2（+）（上图）或兴奋性→Apex2（+）（下图）运动神经元。（J）兴奋→Apex2（+）蠕虫在聚合后运动减缓，而抑制性→Apex2（+）蠕虫表现出轻微的麻痹。（K）聚合后的涕灭威抗性测定。（L）蠕虫胆碱能运动神经元中导电（PANI）和绝缘（PDAB）高分子的聚合示意图。（M）涕灭威抗性测量5小时后的分数总结。

在这篇文章中，研究人员在活细胞，组织和动物的特定细胞上实现了具有电学活性高分子的化学组装。在未来的工作中，研究人员会进一步的解决其潜在的局限性；例如，反应产物可能会在靶细胞内或靶细胞附近占据大量空间，这可能导致细胞毒性。过氧化自由基引发可能具有多种局限性，因此希望更多的发展在细胞内进行基因和解剖学靶向的反应物（例如单体），催化剂（例如酶）以及激发反应的条件（通过调节pH，光，热，氧化还原电势，电化学电势以及其他化学信号），从而对组装结构中广泛的功能进行特征探索以及开发各种细胞特异性的化学合成方法。

https://science.sciencemag.org/content/367/6484/1372

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