上世纪八十年代转基因技术出现以来，极大地推动了生物工程技术的进步和重要农艺性状的改良，然而由于农杆菌转化或者基因枪等转化方式的盲目性，目标靶点和预期性状往往存在较大的不确定性。基因编辑技术尤其是CRISPR/Cas系统的高效性、多功能性和易操作性无疑带来了又一次农业生物技术的飞跃【1】。目前CRISPR基因编辑技术在基因敲除、单碱基编辑等已有大量成功的先例【2，3】，然而CRISPR/Cas9介导的基因插入表达仍然面临许多挑战 ，包括需要借助筛选标记基因（如除草剂）、插入片段较小等，限制了基因插入表达的应用范围和公众接受程度。
近日，加州大学戴维斯分校的植物病理学家Pamela C. Ronald团队在NATURE COMMUNICATIONS杂志发表一篇篇题为Marker-free carotenoid-enriched rice generated through targeted gene insertion using CRISPR-Cas9的研究论文，首次利用CRISPR/Cas9技术成功在水稻中特定位点插入表达5.2kb的类胡萝卜素合成表达组件，获得了富含类胡萝卜素的黄金大米。
研究之初，作者首先分析了粳稻突变体库中形态学表型与插入表达或异位表达位点之间的关系，选取不影响植株表型的位点作为候选转基因插入位点，并且在水稻原生质体中的进行基因编辑预实验，结果证实了候选位点可以被CRISPR/Cas9系统有效编辑。因为黄金大米的重要社会经济价值，而且表型可视化极佳，研究人员构建了GR2（Golden rice 2）表达组件，经过优化，去除了组件中的筛选标记基因和T-DNA边界序列，最终缩小表达组件序列到5.2kb，包括两个类胡萝卜素合成基因SSU-crtI/ZmPsy，由胚乳特异性性表达的谷蛋白启动子介导表达。随后构建了基因编辑供体质粒pAcc-B和CRISPR编辑质粒pCam1300-CRISPR-B，运用基因枪法转基因，经过潮霉素筛选，获得55个T0代植株。 运用保守引物PCR分析T0和T1代植株，筛选到48A-7携带一个全长类胡萝卜素表达组件，并且两端同源臂来源于供体质粒，全基因组序列分析48A-7印证了上述结果，同时确定此次基因编辑没有造成脱靶效应。
Scheme for targeted insertion of the carotenoid cassette
研究人员对48A-7株系进行了评估，与野生型相比种子大小外观没有差别， β-类胡萝卜素含量略低于温室条件下转GR2粳稻品种Kaybonnet， 但高于田间种植的籼稻PSB Rc82。因为全基因组分析发现48A-7株系在五号染色体上存在来自于CRISPR的片段，作者猜测可能是基因枪注射导致，因此通过与野生型水稻回交，经过F1和F2分离，最终将转基因印记去除，获得纯合的富含类胡萝卜素的株系1-11和2-8。 研究人员为了确认β-类胡萝卜素的积累是类胡萝卜素表达组件插入到target-B的作用，对含有类胡萝卜素表达组件的杂合品系48P-3的后代进行分析，发现富含类胡萝卜素与含有类胡萝卜素表达组件事件相关联，且符合孟德尔遗传定律，说明48A-7富含的类胡萝卜素是Target B插入表达组件的作用。 最后作者猜测是否在另外的基因组位点也可以插入表达类胡萝卜素表达组件，实验表明在Target C 位点同样可以编辑， 编辑效率大约6.25%。
Trait assessment of the homozygous carotenoid-enriched rice line 48A-7
综上所述，该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，精确地实现了预期基因的插入表达，在实现作物优良性状提升的同时，不影响植株其他性状，再次印证了CRISPR/Cas基因编辑系统的强大功能和应用价值，虽然是在模式水稻品种kittake上实现，希望很快就可以在有商业价值的品种中得到应用，该研究为作物品质提升策略提供了新的例证和思路。
参考文献
【1】 Barrangou, R. & Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nat. Biotechnol. 34, 933–941 (2016).
【2】 Shan, Q. W. et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31, 686–688 (2013).
【3】 Zong Y, Wang Y, Li C, Zhang R, Chen K, Ran Y, Qiu JL, Wang D, Gao C. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol. 2017;35:438 –40.
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