蛹虫草新型黄色素结构的初步鉴定及响应面优化提取工艺

蛹虫草（Cordyceps militaris），属子囊菌门（Ascomycota）昆虫寄生真菌，在我国被广泛用作民间医药或功能性食品。常被用作冬虫夏草的替代品。蛹虫草具有多种药理功能。

在传统人工培养过程中，光照被用于刺激蛹虫草原基的形成和子实体的分化。为了研究蛹虫草黄色素在蛹虫草发育过程中的重要作用，必须先对蛹虫草黄色素的种类进行鉴定及归类。

华南农业大学食品学院的唐鸿标、陈楚欣、林俊芳*和郭丽琼*等人通过高效液相色谱（HPLC）法对蛹虫草黄色素进行分离纯化，并结合质谱法、紫外-可见光谱法、傅里叶变换红外（FTIR）光谱法对纯化素色进行结构鉴定。同时，采用响应面法对蛹虫草黄色素提取工艺进行优化，为其日后的生产和综合开发利用提供依据。

1. 提取溶剂的比较

图1 不同提取溶剂的比较

如图1所示，蛹虫草黄色素能较好地溶解于水（图1H）、甲醇（图1E）溶剂，以及水分别与甲醇、乙醇的混合液（图1G、1F）。其微溶于乙醇（图1D）、丙酮（图1C）溶剂，在乙醚（图1B）、石油醚（图1A）中溶解性极差，说明水等强极性溶剂的提取效果明显优于石油醚等弱极性有机溶剂。根据相似相溶原理，说明蛹虫草黄色素是一类极性较大的化合物。

2. HPLC、HRMS分析结果

为了进一步了解从蛹虫草中获得的色素种类，采用HPLC分离纯化蛹虫草粗提物，结果显示蛹虫草黄色素有9 个主要峰，各峰的分离度均大于1.5，说明通过反相C18柱可以实现蛹虫草黄色素的有效分离。同时，对第5号峰（保留时间为5.562 min）进行HRMS与全波长扫描测试，结果表明，纯化色素5准分子离子峰为m/z 262.108 6 [M-H]-，并推测其分子式为C14H17N1O4。全波长扫描结果显示，纯化色素5在278、449 nm和477 nm波长处检测到最大吸收波长，表明该色素具有与类胡萝卜素结构相似的不饱和共轭体系。

3. FTIR分析结果

如图3所示，纯化色素5在3 384 cm-1处产生吸收，结合MS结果，氮规则表明该化合物有奇数个N原子存在，故推测此处为仲胺（R—N—H）伸缩振动。样品在3 303 cm-1处有强的宽带（R—O—H伸缩）振动吸收，并且在1 078、1 145 cm-1和1 175 cm-1处有较强的（C—O单键）振动吸收，在1 695 cm-1和1 565 cm-1处产生强的（C＝C）伸缩振动，在876 cm-1处产生（C—H）面外扭摆振动吸收，表明纯化色素5具有与类胡萝卜素相似的红外吸收特征。同时，根据纯化色素5具有不饱和共轭多烯结构的特点，将该色素命名为虫草烯。

4. 单因素试验结果

4.1 甲醇、乙醇溶液体积分数对虫草烯提取量的影响

在提取温度25 ℃、料液比1∶20、提取时间30 min条件下，测定不同体积分数甲醇和乙醇溶液对虫草烯提取量的影响。结果显示，当甲醇、乙醇溶液体积分数为60%，虫草烯提取量最大，分别为（903.13±42.21）μg/g和（1 145.04±59.13）μg/g。选择60%乙醇溶液作为最佳提取溶剂。

4.2 提取温度对虫草烯提取量的影响

在提取溶剂60%乙醇溶液、料液比1∶20、提取时间30 min条件下，测定不同提取温度对虫草烯提取量的影响。结果显示，在较低温度范围内，随着提取温度的升高，增加了水分子的动能，促进了扩散运动的进行，虫草烯提取量不断增加，在40 ℃时提取量达到最大值（1 277.15±57.78） μg/g。超过40 ℃后，高温破坏虫草烯的结构稳定性，导致虫草烯碳链分解，失去原有的光学性质，虫草烯提取量呈现较快的下降。因此，在单因素优化试验过程中，始终保持提取环节在40 ℃以下的工作环境中进行。

4.3 料液比对虫草烯提取量的影响

在提取溶剂60%乙醇溶液、提取温度40 ℃、提取时间30 min条件下，测定不同料液比对虫草烯提取量的影响。结果显示，虫草烯提取量随料液比的增加，呈现先增加后稳定的趋势。当料液比为1∶20时，提取量达到（1 489.71±50.01）μg/g。再增大料液比，提取量的增加不明显，表明溶剂已将有效成分基本溶出完全。同时，过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费，不利于后期浓缩工作的进行。因此，选择1∶20作为最佳的料液比，继续进行优化实验。

4.4 提取时间对虫草烯提取量的影响

在提取溶剂60%乙醇溶液、提取温度40 ℃、料液比1∶20条件下，测定不同提取时间对虫草烯提取量的影响。结果显示，随着提取时间的延长，虫草烯提取量不断增加，当时间超过45 min，提取量趋于降低。提取45 min时，提取溶剂中虫草烯提取量趋向饱和状态，提取量达到（1 915.95±65.98）μg/g，时间不再成为影响提取量的重要因素。但随着提取时间的延长，40 ℃乙醇容易混发，减少的乙醇导致提取量缓慢降低。

5. 响应面试验设计与结果

5.1 响应面试验结果与回归方程拟合

利用Design-Expert V8.0.6软件，对实验结果进行多项式回归分析。经拟合回归，得到综合得率 Y 对自变量 A 、 B 、 C 的回归方程 Y =2 212.08-438.49 A ＋152.21 B ＋179.90 C ＋60.57 AB -112.06 AC ＋5.91 BC -967.37 A 2 -248.90 B 2 -317.68 C 2 。

5.2 响应面模型方差及可行度分析

结果显示，此模型 P 值小于0.01，表明回归模型达到极显著水平。失拟项 P =0.125 4＞0.05，模型失拟度不显著，模型相关系数 R 2 为0.983 3，校正决定系数 R 2 Adj 为0.961 8表明此模型拟合优度好，实验误差小，可用该模型分析和预测各因素对蛹虫草虫草烯提取量的影响。在一次项中，乙醇溶液体积分数、提取时间对蛹虫草虫草烯提取量的影响极显著；提取温度对虫草烯提取量的影响显著。各因素显著性程度依次为乙醇溶液体积分数＞提取时间＞提取温度。

5.3 交互作用分析结果

由图8可知，虫草烯提取量随着乙醇溶液体积分数、提取温度、提取时间的增大呈现先增大后减少的趋势，说明该模型具有极大值。响应面的陡峭程度随乙醇溶液体积分数、提取时间的变化起伏较大，说明乙醇溶液体积分数、提取时间对虫草烯提取量的影响大于提取温度。

5.4 工艺参数优化验证结果

通过软件求解回归方程，最佳蛹虫草虫草烯提取条件为乙醇溶液体积分数57.68%、提取温度44.40 ℃、提取时间52.44 min，预测虫草烯提取量可达到2 299.61 μg/g。在此条件下，测定实际蛹虫草黄色素得率为（2 259.23±83.88）μg/g（表4），与预测值相近，偏差较小，证明了该方程的准确性和实用性。同时，在最佳提取条件下，进行多次提取，确定提取级数和虫草烯在子实体粉末中的最终含量。虫草烯提取量随着提取次数的增加而增大，当提取级数达到第7次时，HPLC已经检测不到虫草烯的存在，此时蛹虫草子实体中虫草烯提取量为（2 780.97±170.38）μg/g。当提取级数达到第3次时，虫草烯提取率已达到99.88%，为了节省提取时间和减少提取溶剂的使用，故确定提取级数为3 级。

结 论

本实验利用HPLC、质谱与FTIR相结合的方法，发现一种新型的蛹虫草黄色素，推测其分子结构式为C14H17N1O4。该色素具有与类胡萝卜素相似的紫外-可见光和红外吸收特征，表明该色素具有不饱和共轭多烯结构的特点，故将其命名为虫草烯。

响应面试验结果显示，各因素对虫草烯提取量的显著性程度依次为乙醇溶液体积分数＞提取时间＞提取温度，确定虫草烯最佳提取工艺条件为乙醇溶液体积分数57.68%、提取温度44.40 ℃、提取时间52.44 min，实际测定虫草烯提取量为（2 259.23±83.88）μg/g。提取级数确定为3 级，此时虫草烯提取率可达99.88%，含量为（2 777.72±170.46）μg/g。

本文《蛹虫草新型黄色素结构的初步鉴定及响应面优化提取工艺》来自于《食品科学》2019年40卷22期299-305页，作者：唐鸿标，陈楚欣，林俊芳，娄海伟，叶志伟，郭丽琼。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181128-341。

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在成功召开“2019年动物源食品科学与人类健康国际研讨会（宁波）”的基础上，将与青海大学农牧学院于2020年6月20-21日在西宁共同举办“2020年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。研讨会将就肉、水产、禽蛋、乳制品等动物源食品科学基础研究、现代化加工技术，贮藏、保鲜及运输，质量安全与检测技术，营养及风味成分分析，副产物综合利用，法律、法规及发展政策等方面的重大理论研究展开深入探讨，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。

在此，我们诚挚的邀请您出席本次国际研讨会，共聚人脉、共享资源、共谋发展！

修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

图片来源于百度图片及文章原文