导读
单酶激活的分子探针已广泛应用于生物成像和疾病诊断，但如何准确的成像和识别仍是一个难题。近日，湖南大学张晓兵团队基于酶的特异性识别设计了酶激活的“双锁”分子探针（NML）用于准确生物成像和肝病鉴别。NML在第一把“钥匙”亮氨酸氨肽酶（LAP）和第二把钥匙单胺氧化酶（MAO）的作用下释放出荧光团（NF）。NML只能在LAP和MAO都存在的情况下被激活，当任一酶被抑制时，NML就会被沉默。得益于“双锁”策略，在药物诱导肝损伤成像方面比“单锁”探针有更高的准确性。NML可用于临床不同肝病患者血清标本的准确鉴别。这种智能分子探针在肝病诊断和临床转化方面具有巨大的潜力。该研究成果发表于Chemical Science上（DOI: 10.1039/C9SC03628H）。
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图1. 探针设计策略、酶激活示意图及准确成像（图片来源：Chem. Sci.）
目前，肝病诊断的标准诊断方法，如组织病理学或分子医学成像，通常在疾病晚期是无效的，导致诊断延迟，从而导致死亡率升高。因此，开发一种简单方便的工具帮助患者在早期进行准确的视觉生物成像和诊断，以及对不同肝脏疾病的鉴别是非常必要的。血清检测以其高效率已成为肝病临床诊断的重要手段。然而，目前临床检测的血清标志物，如放射学和免疫学方法，往往具有较高的检测阈值和假阳性。荧光成像具有良好的时空采样能力，因其高灵敏度和无创性的特点使得它对肝病的诊断和影像学研究具有重要意义。因此，血清检测和体内分子荧光成像的结合有望提供简单和可靠的诊断方法。
在过去的几年中，可活化的分子探针被广泛应用于只有一种已知的酶在病变组织中被上调的选择性活化。然而，仅使用一种标志物作为诊断肝病的标准存在误诊的风险，因为在健康组织中也可能发现假阳性信号。因此，仅对一种酶生物标志物产生反应的探针的应用可能难以满足实际需要。为了克服这个问题，增加第二个选择标准可能是最好的选择。重要的是，由于两种酶的连续裂解，探针可能会出现较低的荧光背景，两种酶的表达量更少，这使得它们在生物成像领域更准确。随着这一趋势，设计两种酶生物标志物激活分子探针用于肝病的准确成像和鉴别具有很大的临床应用潜力。
有研究报道，病变肝细胞的LAP活性高于正常肝细胞。因此，LAP可以作为区分病变肝细胞和正常肝细胞的特异性标志物。MAO的测量有助于肝病的诊断和鉴别诊断，特别是肝硬化的早期诊断。基于以上理论，张晓兵团队决定探讨血清中LAP和MAO的双重激活和成像以达到更准确诊断肝病的目的。
张晓兵团队设计了一个可以通过两个肝病特异性生物标志物(the two “keys”, LAP and MAO)的连续化学转化来解锁的分子探针(NML)。荧光团NF的羟基被对羟基苄基修饰后，第二把“锁”丙胺通过酯键连接到对羟基苄基上从而沉默荧光团NF的近红外（NIR）信号。然后第一把“锁”亮氨酸（Leu）通过伪肽键连接到丙胺上，形成“双锁”分子探针NML。LAP切断伪肽键打开第一把“锁”，使得第二把“锁”被暴露出来，这时MAO通过氧化作用使得酯键断裂。酯键断裂后，对羟基苄基发生消除反应释放荧光团NF，荧光信号增强。
在成功合成探针之后，作者通过荧光和吸收的对比和细胞成像，发现NML只有在LAP和MAO同时存在的情况下才能在体外或体内被激活，但当两种酶只有一种酶存在或被抑制时，NML都保持沉默。在LAP和MAO都存在的情况下，紫外吸收发生红移，720 nm处的荧光随着酶浓度的增加而增强。HepG2细胞成像显示，在抑制剂存在的情况下，几乎没有荧光信号。
图2. NML在各种响应条件下的光谱变化（图片来源：Chem. Sci.）
图3. HepG2细胞的共聚焦图像。a, b, c存在抑制剂，d正常。（图片来源：Chem. Sci.）
随后，作者以药物诱导肝损伤（DILI）为研究对象，评价了NML在准确区分肝病方面的能力。以对乙酰氨基酚（APAP）诱导肝损伤后进行成像分析。与类似探针NL和 NM相比， NML在肝损伤部位40 ~120 min的成像结果显示有更高的荧光增强。注射NML后的肝脏荧光图像显示，正常肝与损伤肝的区别更加明显。
图4.区分肝损伤与正常肝（图片来源：Chem. Sci.）
由于NML在体内外均表现出良好的光谱和成像性能，作者对NML在不同小鼠模型血清中的LAP和MAO成像进行了评价。作者分别用CCl4和APAP建立了肝硬化和肝损伤模型。与NL和NM相比，NML将肝硬化血清(3.3±0.15倍荧光增强)与肝损伤血清(1.8±0.12倍增强)和正常血清区别开来，具有较高的准确性。因此，NML能够在不同模型的小鼠血清中表现出不同的荧光，从而能够区分不同的肝病。
图5. 模型建立与肝病的鉴别（图片来源：Chem. Sci.）
总结：湖南大学张晓兵团队开发了一种酶激活的 “ 双锁 ”分子 探针。该探针可以检测并成像 LAP和MAO， 从而实现对肝病的准确鉴别和成像。这种双酶探针对肝硬化和肝炎的临床诊断有很大的应用前景。改进后的 “双锁定”和“双酶激活”策略可能有助于临床各种介入操作，如成像引导的血清检测或荧光引导的肝组织精确手术等 。撰稿人：犟子柳
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