科普丨纳米孔测序技术发展简介

随着对DNA结构和序列的研究，DNA测序技术不断发展，成为生命科学研究的核心领域，对生物、化学、电学、生命科学、医学等领域的技术发展起到巨大的推动作用。利用纳米孔研究出新型的快速、准确、低成本、高精度及高通量的DNA测序技术是后人类基因组计划的热点之一。

纳米孔检测技术作为一个新型平台，具有低成本、高通量、非标记等优势，可将基因组测序的成本降低到1000美元以下。一些国内外团队积极参与这项研究，尤其是牛津纳米孔公司的Bayley小组首次研发了商用DNA测序设备。纳米孔检测技术有利于促进生命科学的发展，为个体化医疗带来革命，并将人类疾病临床诊断及治疗带入新的时代。

技术起源

纳米孔分析技术起源于Coulter计数器的发明以及单通道电流的记录技术。生理与医学诺贝尔奖获得者Neher和Sakamann在1976年利用膜片钳技术测量膜电势，研究膜蛋白及离子通道，推动了纳米孔测序技术的实际应用进程。1996年，Kasianowicz 等提出了利用α-溶血素对DNA测序的新设想，是生物纳米孔单分子测序的里程碑标志。随后，MspA孔蛋白、噬菌体Phi29连接器等生物纳米孔的研究报道，丰富了纳米孔分析技术的研究。Li等在2001年开启了固态纳米孔研究的新时代。经过十几年的发展，固态纳米孔技术日益发展成熟。

工作原理

纳米孔的基本工作原理：在充满电解液的腔内，带有纳米级小孔的绝缘防渗膜将腔体分成2个小室，如图1，当电压作用于电解液室，离子或其他小分子物质可穿过小孔，形成稳定的可检测的离子电流。掌握纳米孔的尺寸和表面特性、施加的电压及溶液条件，可检测不同类型的生物分子。

由于组成DNA的四种碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的分子结构及体积大小均不同，单链DNA(ssDNA)在核酸外切酶的作用下被迅速逐一切割成脱氧核糖核苷酸分子，当单个碱基在电场驱使下通过纳米级的小孔时，不同碱基的化学性质差异导致穿越纳米孔时引起的电流的变化幅度不同，从而得到所测DNA的序列信息。

技术分类

目前用于DNA测序的纳米孔有两类：生物纳米孔(由某种蛋白质分子镶崁在磷脂膜上组成)和固态纳米孔(包括各种硅基材料、SiNx、碳纳米管、石墨烯、玻璃纳米管等)。DNA链的直径非常小(双链DNA直径约为2nm，单链DNA直径约为1nm)，对所采用的纳米孔的尺寸要求较苛刻。

生物纳米孔

生物纳米孔是天然的生物纳米器件，具有特定的孔径结构、生物活性及能够插入脂双分子层膜的能力，由于可进行灵活的化学或生物修饰而受到科学家的青睐。

α-溶血素(αHL)纳米孔

αHL是目前最广泛使用的生物纳米孔的分析物质，由293个氨基酸多肽构成，可插入到纯净的双分子层脂膜中形成蘑菇状七聚体，组装成跨膜通道。αHL七聚体纳米孔主要由帽型区(Cap，入口cis端直径为2.6nm)、边缘区(Rim，直径为1.4nm)和主干区 (Stem，入口trans端直径为2.2nm)三部分构成。αHL 纳米孔永久开通不关闭，耐强酸和强碱，高温、高电压下较稳定。1996年，Branton小组第一次演示当电流驱使单链DNA穿过镶嵌在磷脂双分子层上的α-溶血素蛋白时会使电流瞬时下降，证明纳米孔蛋白可以用于DNA的检测。随后Kasianowicz等采用α-溶血素蛋白纳米孔对单链DNA、单链RNA易位行为进行研究，提出利用α-溶血素纳米孔实现快速、廉价的DNA测序的设想，是生物纳米孔单分子检测研究的里程碑标志。

英国牛津大学Bayley教授将α-溶血素与核酸酶结合后，利用氨基化环糊精配体固定，将待测核酸上的碱基按顺序剪切后在电场的作用下有序地通过蛋白质纳米孔，使其可以选择性识别四种碱基。英国牛津纳米孔技术公司 (Oxford Nanopore Technologies)成功将该研究成果用于核酸测序。

近期，Schneider小组结合电压控制技术、phi29 聚合酶和α-溶血素纳米孔建立了一个新的测序平台，利用phi29聚合酶将双链DNA解旋，使其中一条单链穿过镶嵌在磷脂双分子层中的α-溶血素纳米孔，通过电流的变化，获得DNA的序列信息。phi29 聚合酶的解旋速度可相应降低DNA在纳米孔中的迁移速度，有利于捕获更为准确的序列信息。

MspA纳米孔

耻垢分枝杆菌中的孔蛋白(Mycobacterium smegmatis porinA，MspA)是适合研究DNA测序的另一个纳米孔蛋白。呈圆锥状，八聚体孔蛋白，有一个宽约1.2nm，长约0.6nm的短窄的收缩区。与5nm长的α-溶血素蛋白孔相比，更有利于对单碱基的测定。Gundlach教授首次报道将核酸末端连接核酸分子夹，利用MspA纳米孔识别四个单碱基的技术，可减缓DNA的穿越速度，提高DNA单碱基的检测灵敏度。

固态纳米孔

固态纳米孔主要是在氮化硅、二氧化硅和石墨烯等绝缘材料上用离子刻蚀技术、电子刻蚀技术、聚焦电子束(FEB)或离子束(FIB)等制作出的微小孔洞。

目前固态纳米孔的制备，首先用常规微加工技术制作30～500nm厚的悬空薄膜，再用离子束或电子束等在硅或其他材料薄膜表面钻出2～100nm的孔洞。DNA检测中所需的纳米孔直径都是1～2nm，可在前述研究的基础上，进一步采用沉淀物质收缩、离子束辐射、电子束辐射等收缩技术减小纳米孔的尺寸，从而达到更小目标尺寸的纳米孔。

哈佛大学Li等在2001年首次报道了使用离子刻蚀技术在Si3N4薄膜上制作出了直径61nm的孔，同时利用氩离子束辐射使纳米孔收缩到1.8nm。开启了固态纳米孔制备和研究的新时代，使固态纳米孔技术日益成熟，丰富了纳米孔单分子检测技术研究。

近十几年来，由于固态纳米孔具有稳定及耐用等特点，越来越受到科学家的青睐，制作固态纳米孔的技术、设备和材料的不断更新，使其研究有着突飞猛进的发展。

未来展望

利用纳米孔技术对DNA进行测序，要真正实现商业化应用，还面临着严峻的挑战，需要科学家进一步探索，如提高通道的选择性和灵敏度、控制DNA穿越速度及提高信噪比等。除DNA测序外，纳米孔的无需标记、无需放大的单分子检测技术还可以在RNA检测、蛋白质检测等各种重大疾病的生物标志物检测方面得到应用。相信随着纳米孔技术的深入研究，以及各项科学技术的结合使用，将使其在化学、物理学、生物学、电子学和医药学中的应用更加广泛，对生命奥秘的探索、疾病的治疗，以及整个生命科学的发展起到巨大的推动作用。

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