《食品科学》：武汉轻工大学闫达中教授等：Alteromonas sp. A1-6中褐藻胶裂解酶Alg2579的酶学性质

褐藻是海洋生态系统初级生产力的重要来源，拥有巨大的生物量，是生产生物燃料的重要原料之一。褐藻胶又称海藻酸盐，是海洋褐藻中含量最丰富的多糖之一，占褐藻生物量的40%。它由α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸通过1,4-糖苷键以交替排列的方式聚合而成，α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸互为C5差向异构体。根据两种单糖在褐藻胶内含量的不同可将其分为3 种类型：聚甘露糖醛酸（Poly M）、聚古罗糖醛酸（Poly G）和混合型（Poly MG）褐藻胶。嵌段类型和分子质量会影响褐藻胶的成胶能力和黏度；单体的排列方式也是影响褐藻胶性能的重要因素。据报道，多糖的柔韧性随着α-L-古罗糖醛酸含量的增加而降低。褐藻胶具有凝胶形成和金属离子螯合能力，且天然环保、安全易降解、原料来源丰富。基于这些优异特性，它在食品、化学、医药等领域被广泛应用。

褐藻寡糖（AOS）是海藻酸盐的降解产物，根据组成AOS的单体类型的不同可将其分为3 种：古罗糖醛酸寡糖（GAOS）、甘露糖醛酸寡糖（MAOS）和杂合糖醛酸寡糖。目前，AOS的研究和应用大多基于AOS的混合物，能够生产单一类型AOS的方法目前研究报道的还比较少。AOS分子质量低、水溶性较高，且溶液黏度较低，具有抗氧化、降血糖血脂、调节肠道菌群和促进植物生长的能力。因此，AOS被广泛地应用于食品和医药等行业。在食品领域，AOS可作为一种生物活性成分发挥作用，它具备抗氧化能力，可以清除超氧化物和羟自由基等活性氧，降低食品中的氧化应激水平。AOS凭借其调节肠道菌群、抑制脂质吸收的特性，可用于开发专注于质量管理与血糖控制的功能性食品。AOS可以作为质地改良剂，添加到冰淇淋中，防止在冷冻过程中形成冰晶，从而使产品口感更加顺滑、细腻；也可以作为稳定剂用在沙拉酱或调味汁中，降低水和油分离的可能性，保持体系的均一稳定。总之，AOS的开发和使用顺应了全球健康消费趋势，为开发高附加值、具有特定健康裨益的功能性食品提供了更多选择。

褐藻胶裂解酶可以通过β-消除反应从非还原端C4和C5之间的1,4-糖苷键降解褐藻胶，产生不饱和AOS。目前，褐藻胶裂解酶已从多种生物中分离出来，包括海洋和陆地微生物及海洋无脊椎动物。通常，细菌来源的酶表现出对Poly G的偏好，而软体动物来源的酶表现出对甘露糖醛酸的偏好。基于氨基酸序列同源性、三维结构特征及催化机制，在CAZy数据库（http://www.cazy.org/）中将目前发现的藻酸裂解酶归类为PL5、6、7、14、15、17、18、32、34、36和39家族。经分析重组酶Alg2579是属于PL6家族的褐藻胶裂解酶。不同的褐藻胶裂解酶具有不同的底物偏好性，主要分3 类：Poly G特异性裂解酶（EC 4.2.2.11）、Poly M特异性裂解酶（EC 4.2.2.3）以及可以同时降解两种片段的双功能裂解酶（EC 4.2.2.-）。目前，研究的大多数裂解酶都为Poly M特异性裂解酶。根据酶作用机制的不同，又可以将其分为内切型褐藻胶裂解酶和外切型褐藻胶裂解酶。大多数内切型褐藻胶裂解酶存在于家族PL5和PL7中，外切型褐藻胶裂解酶存在于家族PL6、PL7、PL14、PL15以及PL17中，同时具有内切和外切活性的双功能酶鲜有研究报道。褐藻胶完全降解需要内切酶和外切酶的共同作用，一些利用褐藻胶裂解酶协同作用高效降解褐藻胶的研究被广泛关注。

系统挖掘与功能解析褐藻胶裂解酶资源，筛选具有Poly G底物偏好性的新型裂解酶，利用其抗氧化能力，对精准制备GAOS及开发褐藻胶资源在食品和农业领域的应用具有重要科学价值与应用潜力。武汉轻工大学生命科学与技术学院的李静、梁潼和闫达中*等利用生物信息学分析，从褐藻胶降解菌Alteromonas sp. A1-6基因组中挖掘到褐藻胶降解基因alg2579，经克隆和异源表达后，分析褐藻胶裂解酶Alg2579的酶学性质和底物偏好性，探究酶解产物的成分与抗氧化活性，并以典型褐藻海带为研究对象，分析Alg2579对海带的降解效果以及酶解产物是否具有促进小麦生根的作用。

1 荧光定量PCR检测基因alg2579的表达水平

对褐藻胶降解菌A1-6进行全基因组测序，并经RAST平台（https://rast.nmpdr.org/）分析后，预测alg2579基因（GenBank收录号：PX564740）编码一种褐藻胶裂解酶。为验证此预测结果，以海藻酸钠为底物诱导培养该菌，随后进行荧光定量PCR实验。以琥珀酸培养的该菌基因表达水平为对照进行归一化处理，2-ΔΔCt法计算相对表达量。由图1可知，经海藻酸钠诱导后，基因alg2579的转录水平显著上调，初步推断基因alg2579为褐藻胶降解相关基因。

2 Alg2579的生物信息学分析

基因alg2579的长度为2 244 bp，编码748 个氨基酸，通过在线网站SignalP 6.0推测其N端有一个由19 个氨基酸组成的信号肽，ProtParam在线平台预测结果显示，蛋白的分子质量为82.311 kDa，理论等电点为5.51。将Alg2579与CAZy数据库中已注释过的褐藻胶裂解酶基因序列进行比对，发现其与来自Alteromonas macleodii ATCC 27126菌株的褐藻胶裂解酶一致性最高（63.96%）（图2A），但该酶目前并没有被表征，其酶学性质等特征并不清楚。NCBI Conserved Domain的结构域分析显示，Alg2579具备PL6超家族的典型结构域，其结构特征符合已知的PL6家族褐藻胶裂解酶（图2B）。保守域与多序列比对分析表明，Alg2579的关键催化残基（Lys238、Arg259）和Ca2+结合位点（Asn199、Glu231、Glu233）在PL6家族中高度保守，据此推测Alg2579属于PL6家族成员（图2C）。

3 褐藻胶裂解酶的克隆与表达

以褐藻胶裂解菌A1-6的基因组为模板，PCR扩增出目的基因alg2579。去除了信号肽基因序列的目的基因长度为2 187 bp，通过琼脂糖凝胶电泳图可知PCR产物条带长度符合预期。连接目的基因与载体后，将构建的重组质粒pET28a-alg2579转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑选阳性克隆子并提取质粒，以重组质粒为模板进行PCR验证后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与目的基因的序列一致，表明重组质粒pET28a-alg2579构建成功。

4 Alg2579的表达与纯化

测序后的重组质粒成功转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，该菌株在16 ℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导16 h后，成功表达出目的蛋白Alg2579。细胞破碎后经离心收集上清液，所得粗酶液经滤膜过滤后上样至Ni-NTA亲和层析柱，并采用梯度浓度咪唑溶液进行洗脱，以纯化目的蛋白。通过SDS-PAGE对纯化后的组分进行评估，发现120 mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白的效果最佳，条带分子质量与理论值（82.31 kDa）吻合（图3），证实了纯化蛋白的正确性。

5 酶动力学参数分析

以甘露糖质量浓度为横坐标、OD540 nm为纵坐标，绘制得到标准曲线回归方程：y＝3.469 35x+0.000 89 （R2＝0.992 24）。体系在最适反应条件下，以不同浓度的海藻酸钠为底物测定酶催化反应速率，并绘制反应速率随底物浓度变化的动力学曲线，采用Michaelis-Menten模型对该动力学曲线进行非线性拟合（图4）。Alg2579的Vmax为0.019 μmol/min，Km为2.521 mg/mL，kcat为0.579 s-1，kcat/Km为0.230 mL/（mg·s）。

6 酶学性质分析

6.1 最适pH值和pH值稳定性

重组酶Alg2579在pH 9.0时相对酶活力达到最大值，在pH 4.0～9.0范围内相对酶活力随pH值升高而递增，当pH值超过9.0后酶活力降低（图5A），表明重组酶Alg2579的最适pH值为9.0。

pH稳定性分析表明，Alg2579在不同pH值条件下孵育30 min后，平均相对酶活力为（94.06±6.62）%，其中pH 6.0的相对酶活力最低，为（82.39±2.97）%（图5B）；pH 9.0的相对酶活力最高，为（102.72±3.37）%。孵育1 h后，在中性条件（pH 6.0～8.0）下，酶活力大幅下降，在pH 6.0～7.0环境下孵育2 h后，平均相对酶活力仅为（21.83±3.71）%。在最适pH条件下孵育2 h，相对酶活力为（80.55±2.26）%。而在碱性条件（pH 10.0～11.0）下孵育2 h后，仍能保留（70.24±2.48）%的酶活力，表明其在碱性环境中具有较好的稳定性。

6.2 最适温度和温度稳定性

重组酶Alg2579在30 ℃时相对酶活力达到最大值，在0～30 ℃范围内，随着温度的升高，酶活力呈逐渐上升趋势，超过30 ℃后酶活力明显下降（图5C），表明重组酶Alg2579的最适温度为30 ℃。

温度稳定性分析结果表明，重组酶Alg2579在10～30 ℃的范围内具有良好稳定性，在10 ℃孵育1 h后相对酶活力提高至（131.78±2.46）%，孵育2 h后相对酶活力保持在（94.67±1.53）%（图5D）；在20 ℃孵育30 min后相对酶活力达到（149.56±2.22）%，孵育2 h后降至（72.44±2.23）%；在30 ℃孵育30 min后相对酶活力为（124.33±3.71）%，孵育2 h后降至（51.01±2.41）%；而当温度高于30 ℃时，酶活力进一步降低，孵育2 h后相对酶活力不足20%，反映出该酶对高温较为敏感。

6.3 金属离子对酶活力的影响

重组酶Alg2579受Fe2+、Cu2+、Zn2+及金属螯合剂乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）影响较大，在1 mmol/L EDTA条件下，相对酶活力降至（33.55±1.26）%，当浓度升至5 mmol/L时，相对酶活力进一步降至（12.36±0.48）%。相比之下，1 mmol/L Co2+、Mn2+、Mg2+和Ni2+对酶活力影响较小，其中，Ni2+处理后相对酶活力为（95.04±3.51）%；当浓度升至5 mmol/L时，Co2+、Mn2+抑制作用增强，相对酶活力分别降至（57.69±4.69）%和（66.78±6.05）%，而Mg2+和Ni2+保持较高活性，相对酶活力分别为（84.12±9.46）%和（85.87±6.06）%。此外，1 mmol/L Ca2+可提高酶活力至（159.01±1.32）%，但5 mmol/L高浓度下，相对酶活力降至（57.69±3.07）%（图6）。

6.4 有机试剂对酶活力的影响

二硫苏糖醇（DTT）对重组酶Alg2579的催化活性具有明显促进作用。经不同浓度DTT处理后，相对酶活力分别提高至（145.32±5.37）%和（194.88±14.85）%，表明还原剂可显著增强酶活力。Alg2579对多种低浓度有机试剂表现出良好的耐受性，各处理组的相对酶活力均保持在80%以上。其中，在1 mmol/L盐酸胍溶液处理后仍保留（80.19±0.79）%的酶活力。当试剂浓度升高时，酶活力出现不同程度下降。在5 mmol/L Triton X-100条件下，Alg2579仍保持较高活力（（90.11±3.62）%）；在5 mmol/L盐酸胍溶液和β-巯基乙醇溶液中，相对酶活力分别为（68.34±3.62）%和（70.51±6.01）%。Alg2579在体积分数20%的甲醇溶液和DMSO溶液中的相对酶活力分别为（64.53±3.77）%和（63.31±3.24）%，表明其对上述5 种高浓度有机试剂有较好的耐受性；而乙醇和异戊醇对酶活力的抑制作用较明显，其相对酶活力分别降至（45.49±4.02）%和（51.79±1.41）%（图7）。

6.5 底物偏好性分析

重组酶Alg2579对于Poly G的催化活性远高于海藻酸钠和Poly M，比活力为1.383 U/mg；对Poly M的催化活性次之，比活力为0.403 U/mg；对海藻酸钠的催化活性最低，比活力仅为0.258 U/mg（图8），推断该酶是一种对Poly G具有偏好性的聚古罗糖醛酸裂解酶。

7 褐藻胶裂解酶水解产物组成及性质的分析

7.1 褐藻胶裂解酶水解产物组成

质谱检测结果表明，反应30 min时，重组酶Alg2579催化海藻酸钠生成不饱和褐藻单糖（DEH）[ΔDP1-H]-、饱和褐藻单糖[ΔDP1-H]-和不饱和二糖[ΔDP2-H]-（图9A1）；催化Poly M生成饱和褐藻单糖、不饱和褐藻单糖和聚合度（DP）为2～4的不饱和寡糖（图9B1）；催化Poly G生成饱和褐藻单糖、不饱和褐藻单糖和二糖、三糖[ΔDP3-H]-和四糖[ΔDP4-H]-（图9C1）。过夜反应后，重组酶催化海藻酸钠新生成了DP 3～5的不饱和寡糖（图9A2）；催化Poly M新生成了不饱和五糖[ΔDP5-H]-（图9B2）；催化Poly G得到的产物成分不变（图9C2）。未加入褐藻胶裂解酶处理的海藻酸钠、Poly M、Poly G的对照组中均未检测到寡糖生成（结果未显示），说明反应液中生成的产物均为褐藻胶裂解酶Alg2579催化反应的结果。

该酶可以催化上述3 种底物产生饱和与不饱和单糖，推断Alg2579是一种外切酶。同时也检测到DP 2～5的不饱和寡糖产物，表明重组酶具有褐藻胶内切酶活性。因此，重组酶Alg2579是一种同时具有内切和外切酶活性的褐藻胶裂解酶。

7.2 酶解产物的抗氧化活性

以Fe2+质量浓度（mg/mL）为横坐标、OD593 nm为纵坐标，绘制得到标准曲线回归方程：y＝23.471 18x+0.018 44（R2＝0.998 5）。将Alg2579加入海藻酸钠溶液中反应1 h，其产物的FRAP为（0.124±0.007）µmol/mL，产生的还原糖质量浓度为（0.184±0.003）mg/mL；反应24 h后，产物FRAP增加至（0446±0010）µmol/mL，产生的还原糖质量浓度增加至（0.409±0.007）mg/mL（图10）。重组酶Alg2579酶解海带的产物同样具有抗氧化活性，反应1 h后产物FRAP为（0.163±0.005）µmol/mL，产生的还原糖质量浓度为（1.195±0.012）mg/mL；反应12 h后，产物FRAP增加至（0.233±0.016）µmol/mL，产生的还原糖质量浓度增加至（1.992±0.017）mg/mL，展现出较强的还原糖释放能力（图10）。

7.3 海带酶解产物对小麦种子生长的影响

由表1可知，0.05 mg/mL和0.1 mg/mL的海带酶解液对小麦具有促生长作用，酶解液质量浓度提高至1 mg/mL时对小麦具有抑制作用。在还原糖质量浓度为0.05 mg/mL 酶解产物的培养下，小麦种子的生长状况最佳，72 h的平均根长为3.83 cm，与蒸馏水组存在显著差异（P＜005），表明酶解产物促进了小麦根的生长。

8 讨 论

对A1-6的基因组进行分析挖掘，alg2579被注释为褐藻胶裂解酶基因，以海藻酸钠为唯一碳源进行诱导培养后发现alg2579的转录水平上调，表明其功能与褐藻胶降解相关。重组酶Alg2579属于褐藻胶裂解酶第6家族（PL6），最适温度为30 ℃，最适pH值为9.0，在pH 9.0～11.0碱性条件下能保持70%以上的酶活力，显示出优异的碱性稳定性。该酶对多种金属离子耐受性良好，Ca2+对其活性有促进作用，这一结果与PL6家族褐藻胶裂解酶在催化过程中依赖Ca2+的特性一致。DTT可以提高酶的催化活性，高浓度DTT可使其酶活力提高约95%。DTT的激活效应可能是通过还原酶分子中抑制性的二硫键，并维持活性位点关键巯基的还原状态实现的。此外，重组酶Alg2579具有良好的有机溶剂耐受性，在低浓度条件下，Alg2579对各类有机溶剂均表现出良好的耐受性，相对酶活力均保持在80%以上；在高浓度条件下，在体积分数为20%的甲醇溶液和DMSO溶液中，Alg2579的相对酶活力仍然保持在60%左右，在5 mmol/L Triton X-100中，Alg2579的相对酶活力保持在90%以上。目前对PL6家族酶的有机溶剂耐受性的报道很少。在利用褐藻制备AOS的生产工艺中，预处理阶段常使用有机溶剂去除杂质或改善褐藻胶的溶解性，然而，这些有机溶剂对后续酶解过程中所用的褐藻胶裂解酶活力和稳定性产生不利影响。因此，具有良好有机溶剂耐受性的褐藻胶裂解酶有助于提高酶解效率和产物得率，这一特性使其在利用有机溶剂预处理的工业应用场景中更具潜力。

LC-MS检测到重组酶Alg2579水解海藻酸钠、Poly G、Poly M 3 种底物产生的产物包括DEH、饱和褐藻单糖和DP 2～5的寡糖，因此重组酶Alg2579是一种兼具褐藻胶内切和外切活性的双功能酶。在已报道的褐藻胶裂解酶中，大多数都是具有内切活性的酶，对外切活性的褐藻胶裂解酶和双功能酶的报道有限。PL6家族中的褐藻胶裂解酶大多数属于内切型，如AlyRm 1、AlyPL 6、OUC-SCCD 6、BcelPL 6和AlyF等，它们以内切模式产生DP 2～6的寡糖，只有少部分属于外切活性的褐藻胶裂解酶，如AlyGC、Pedsa 0632。同时，DEH是褐藻胶生物炼制系统中一种有前途的碳源，可以作为原料生产乙醇。因此，作为同时具备外切和内切活性的褐藻胶裂解酶Alg2579在工业应用中有良好的前景。

底物偏好性分析结果表明，重组酶Alg2579对Poly G的比活力分别是其对Poly M和海藻酸钠的3 倍和5 倍，因此，重组酶Alg2579对Poly G具有偏好性。有研究表明，与MAOS相比，GAOS在免疫调节和防御病原体方面具有更大优势，基于GAOS的药物OligoG CF-5/20已进入临床试验阶段。Alg2579在开发具有高附加值的Poly G产品方面具有潜在应用价值。

功能活性实验证实，Alg2579酶解海藻酸钠和海带的产物均具备抗氧化活性。有研究表明，AOS的抗氧化性使其拥有清除自由基的能力，且分子质量越小，其抗氧化活性越高。基于抗氧化性，Alg2579的酶解产物可用于肉制品、水产品、果蔬的保鲜，延长货架期等。陈丽娇等的研究表明，使用AOS保鲜涂膜，可以抑制细菌总数的增长，延长大黄鱼保鲜期，其保鲜效果明显优于普通冰藏保鲜法；于功明等研究发现，海藻酸钠与卡拉胶的复合可大大提高肉制品的品质。在未来，Alg2579的酶解产物也有希望应用于功能性食品的开发。

生长实验表明，还原糖终质量浓度为0.05 mg/mL的海带酶解液能够显著促进小麦种子生根。Natsume等发现，A. macleodii中的褐藻胶裂解酶分解海藻酸钠后的产物褐藻三糖具有促进大麦根部生长的活性。刘航的研究表明，AOS能够促进植物叶绿素合成，诱导小麦胁迫保护剂-脯氨酸积累，产生抗逆酶类，清除由于渗透胁迫产生的氧自由基。抗氧化活性与促进生根并非简单的因果关系，而是一种协同关系。抗氧化活性为激素驱动的生根过程创造了必要的低胁迫环境；同时，健康、快速生长的根系也能更好地吸收水分和养分，进一步增强植物的整体健康和对逆境的抵抗能力，形成正向循环。以上研究证明，AOS对植物的生长确实具有促进作用。因此，Alg2579生产的AOS在农业领域同样具有一定的应用潜力。

然而，该酶目前的催化效率尚不能满足实际应用需求。后续研究可通过蛋白质晶体结构解析，深入探究其底物识别与双功能催化机制，并借助理性设计或定向进化策略对其进行改造，以期提升其催化效率，最终推动其产业化应用。

9 结 论

本研究从褐藻胶降解菌株A1-6中克隆并异源表达了对Poly G具有偏好性的褐藻胶裂解酶Alg2579，经系统发育树分析可知该酶属于PL6家族。Alg2579的最适pH值为9.0，最适温度为30 ℃，在碱性环境中稳定性较好，低浓度的Ca2+对Alg2579的催化活性有促进作用，且表现出良好的有机溶剂耐受性。LC-MS分析结果表明，该酶催化海藻酸钠、Poly M、Poly G生成的终产物是DEH、饱和褐藻单糖和DP 2～5的不饱和AOS，证明Alg2579是一种同时具有内切和外切酶活性的聚古罗糖醛酸裂解酶。重组酶Alg2579酶解海藻酸钠和海带的产物表现出较强的抗氧化活性，海带酶解液能够显著促进小麦根的生长。以上这些特性使重组酶Alg2579在GAOS的制备、功能性食品和药物的开发及农业生产领域具有巨大的应用潜力。

引文格式：

李静, 梁潼, 董明俐, 等. Alteromonas sp. A1-6中褐藻胶裂解酶Alg2579的酶学性质[J]. 食品科学, 2026, 47(12): 118-129. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251118-129.

LI Jing, LIANG Tong, DONG Mingli, et al. Biochemical characterization of alginate lyase Alg2579 from Alteromonas sp. A1-6[J].Food Science, 2026, 47(12): 118-129. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251118-129.

实习编辑：杨瑞蕾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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