【JACS】兰州大学雷新响团队：酪氨酸酶催化Tyr–Aniline偶联实现多肽编辑、环化及噬菌体展示配体筛选

导语

环肽兼具较大的分子识别表面和一定的构象预组织能力，在维持高亲和力和高选择性的同时，通常还具有较好的抗蛋白酶降解能力，因此被广泛用于探索蛋白 –蛋白相互作用界面及其他传统小分子较难覆盖的靶点。随着噬菌体展示、mRNA 展示等基因编码筛选技术的发展，活性多肽的发现效率得到显著提升，但这类文库的化学组成仍主要由天然氨基酸决定，能够覆盖的骨架类型和功能基团相对有限。如何在不破坏基因型–表型对应关系的前提下，对已编码多肽进行进一步化学拓展，已成为提升环肽文库多样性和筛选能力的重要方向。

天然氨基酸残基的选择性后期修饰为此提供了一条直接路径。通过在多肽合成或表达完成后，对特定位点进行化学转化，可以进一步引入非天然功能基团、连接单元或构象限制，而无需重新构建整个序列。其中，酪氨酸侧链具有独特的酚羟基反应特征，且在蛋白表面和分子识别界面中具有较高的可利用价值，因此成为多肽后期功能化和骨架重塑中一个重要的天然反应位点。

雷新响教授课题组近年来围绕噬菌体展示肽库的骨架化学编程与活性环肽发现开展了系列研究，先后将多种化学环化、光化学环化及酶催化环化策略引入噬菌体展示体系，并用于疾病相关蛋白靶标的环肽配体筛选与发现（New J. Chem.2022, 46, 10299；Chem. Sci.2024, 15, 11847；J. Am. Chem. Soc.2025, 147, 35090；Angew. Chem. Int. Ed.2026, 65, e18628；Sci. Adv.2026, 12, eaeb7086；Angew. Chem. Int. Ed.2026, 65, e3703404，Org. Lett.2026, 28. 11398. ）。这些工作逐步拓展了噬菌体展示环肽文库的成环化学、骨架拓扑及可筛选化学空间，并为进一步利用天然氨基酸位点实现噬菌体展示肽库的后表达化学多样化奠定了基础。

近日，兰州大学雷新响教授团队建立了一种基于酪氨酸酶催化Tyr–Aniline偶联反应的模块化多肽工程平台，实现了从多肽后期化学编辑、肽–肽偶联和大环化，到基因编码噬菌体展示环肽库构建及靶向筛选的完整贯通（DOI: 10.1021/jacs.6c16766）。

图1. 酪氨酸选择性修饰策略及酪氨酸酶催化Tyr–Aniline偶联在多肽编辑、偶联、大环化与噬菌体展示筛选中的应用。（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

酪氨酸酶能够在温和水相条件下将Tyr氧化为高反应活性的o-quinone，随后与芳香胺发生偶联。已有研究已经证明，这类反应可用于蛋白质修饰和多肽钉合。在此基础上，本研究进一步利用Tyr作为天然反应位点，通过更换不同的芳香胺试剂，在多肽上灵活引入不同功能基团或连接结构。这样既保留了多肽本身的序列信息，又能在后期进一步扩展其化学结构和功能。

前沿科研成果

作者首先以 AcHN-QRGGY-CONH ₂ 和苯胺为模型底物，对反应条件进行了系统优化。结果表明，该反应能够在温和水相条件下快速进行，在PBS（pH 6.5）中仅需约3 min即可接近完全转化，并表现出良好的缓冲液和有机助溶剂兼容性。

图2. 酪氨酸酶催化 Tyr–Aniline 偶联反应的条件优化。（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

在此基础上，作者进一步系统考察了芳香胺及多肽底物范围。多种简单苯胺衍生物、卤代芳胺、含硼酸、氰基及羧基等官能团的芳胺均可参与反应；同时，该体系还能够兼容萘胺、氨基吲哚以及一系列具有化学生物学应用价值的功能模块，包括荧光基团、生物活性结构和双功能连接子等。不同长度、序列、带电性质及生物来源的无保护多肽也能够顺利参与反应，显示出良好的底物适用性。

图3. 酪氨酸酶催化Tyr–Aniline偶联的芳香胺与多肽底物适用范围。（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

在建立单Tyr多肽后期编辑体系后，作者进一步探索该反应能否用于更加复杂的多肽骨架构建。通过引入双官能化苯二胺连接子，两个Tyr经酪氨酸酶氧化后可分别与连接子两端发生偶联，从而实现分子内大环化。研究发现，p-、o-和m-苯二胺均可有效介导双Tyr多肽环化，对应代表性产物8a、8b和8c的HPLC收率分别为76%、67% 和58%。该策略对不同Tyr–Tyr间距的多肽同样表现出良好兼容性。值得注意的是，当两个Tyr之间分别间隔10个和12个氨基酸残基时，相应大环产物仍可分别以78%和80%HPLC收率获得，表明该方法能够适应不同环尺寸和多肽拓扑结构。除分子内大环化外，该Tyr–Aniline偶联还可用于分子间肽–肽组装。通过双官能连接子，作者实现了同源多肽二聚和异源多肽偶联，进一步展示了该反应从单点后期修饰向高阶多肽结构构建拓展的能力。

图4. 双官能Tyr–Aniline偶联介导的多肽大环化及肽–肽偶联。（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

在游离多肽体系中验证Tyr–Aniline偶联可用于大环化后，作者进一步将该反应拓展至噬菌体展示平台，构建了单价M13 pIII的YX₈Y随机肽文库，并利用对苯二胺和酪氨酸酶在噬菌体表面实现原位环化。感染性实验表明，优化反应条件对噬菌体活性影响较小；进一步通过HRV 3C酶切释放展示肽并进行LC–HRMS分析，直接证实了目标大环结构可在噬菌体表面形成。随后，以Keap1为靶标进行多轮筛选，获得代表性环肽CM1，其与Keap1的结合亲和力达到Kd = 211 ± 60 nM，明显优于线性前体M1（Kd = 5.1 ± 0.8 μM），且血浆稳定性显著提升。丙氨酸扫描和¹H–¹⁵N-HSQC NMR进一步证实CM1中ETGE-like区域参与Keap1识别。为验证平台的通用性，作者采用相同策略对EphA4进行独立筛选，获得环肽CN1，其结合亲和力为Kd = 965 ± 32 nM，明显优于线性前体N1（Kd = 28.82 ± 4 μM）。这些结果表明，该平台可实现从噬菌体表面原位环化到不同蛋白靶标配体发现的一体化应用。

图5. 噬菌体展示及亲和力验证。（图片来源： J. Am. Chem. Soc.）

本研究建立了一种基于酪氨酸酶催化酪氨酸–苯胺偶联的多肽化学平台，将多肽后期修饰、大环构建、肽–肽偶联与噬菌体展示环肽文库筛选整合于同一体系。该方法反应条件温和、速度快，并具有较好的底物兼容性。进一步地，作者实现了噬菌体表面原位环化，并分别获得靶向Keap1和EphA4的环肽配体，其中代表性环肽较线性前体表现出更高的结合亲和力和更好的血浆稳定性。该研究将天然氨基酸选择性化学由单一后期修饰进一步拓展至基因编码环肽文库构建与活性配体发现，为环肽药物研发提供了新的技术路径。

相关工作发表于Journal of the American Chemical Society。兰州大学天然产物化学全国重点实验室2023级博士研究生明巍为本文第一作者，雷新响教授为本文通讯作者。上述研究工作得到了甘肃省科技重大专项的资助。

论文信息

Tyrosinase-Catalyzed Tyr–Aniline Coupling Enables Peptide Editing, Macrocyclization, and Phage-Display-Based Selection

Journal of the American Chemical Society

https://doi.org/10.1021/jacs.6c16766

作者简介

通讯作者：雷新响，男，博士生导师，药物化学专业，博士 ， 现为兰州大学教授 。毕业于中国科学院成都生物研究所，曾于2010–2011年在耶鲁大学从事mRNA与蛋白质相互作用研究工作。曾任中南民族大学药学院副院长和民族药学国家级实验教学示范中心主任。从事基于核磁共振波谱技术的药物分析、天然产物结构鉴定、活性筛选等研究工作。现讲授波谱分析，曾讲授化学生物学、生物化学、结构生物学、药事管理学等课程，主持国家自然科学基金面上项目及国际合作等项目。以通讯作者或第一作者在 J. Am. Chem. Soc. , Angew. Chem. Int. Ed. , Sci. Adv. , Nucleic Acids Res. , ACS Nano , ACS Catal. , Chem. Sci. , Cell Chem. Biol. , Anal. Chem. , Org. Lett. , Chem. Commun. , Chem. Eur. J. , Magn. Reson. Chem. 等期刊发表系列SCI论文。任 Nat. Prod. Bioprospect. 编委、 Magn. Reson. Lett. 编委。现任中国化学会有机分析专业委员会委员、湖北省药学会理事、湖北省晶体学会理事，组织多次国际学术会议，在全国性和国际性学术会议上作报告 5 0余次，并受 Nature 、 Angew. Chem. Int. Ed. 、 Nat. Commun. 等期刊邀请担任审稿人。

第一作者：明巍，兰州大学博士研究生，药物化学生物学方向。

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