组织/细胞DNA提取实验操作要点

DNA提取是分子生物学基础实验，是PCR、基因测序、酶切、基因分型等后续实验的前提。DNA提取质量直接决定了下游实验的成败，样本前处理、裂解消化、核酸吸附、洗涤、洗脱每一步操作失误，都可能造成DNA降解、得率低下、蛋白与RNA污染。下面我们就结合最常用的柱式提取法，梳理组织、细胞样本DNA提取的核心操作要点与关键注意事项，为大家实验的顺利开展提供一些参考。

一、样本前处理要点

样本本身质量是获得高质量DNA的首要条件，样本保存与预处理不当，会直接出现DNA断裂、降解，造成后续实验失败。

1. 组织样本

取适量组织材料，优先两种处理方式：1）液氮冷冻后研磨成粉末，再加入裂解体系；2）组织剪碎后直接进行匀浆处理。对于纤维丰富、骨质、脂肪含量高的组织，要充分剪碎，避免大块组织裂解不完全。

样本离体后要尽快处理，若不能立刻提取，应放置于‑80℃超低温冰箱长期保存，也可使用DNA保存液常温短期保存；避免反复冻融，反复冻融可造成基因组DNA断裂降解。也不建议长期‑20℃保存组织样本，可能会发生核酸降解。

2. 细胞样本

-贴壁细胞：使用胰酶充分消化收集细胞，离心弃去培养基上清，收集细胞沉淀；不要过度消化，过度消化会损伤细胞膜，造成核酸释放后被胞内核酸酶降解。用无菌PBS洗涤细胞沉淀1‑2次，去除残留血清、培养基杂质。

-悬浮细胞：直接离心收集细胞沉淀，弃上清，PBS重悬洗涤，再次离心去除洗涤液。

注意：细胞沉淀不要过量，超出试剂盒最大上样量，会裂解不充分；样本量过低，DNA总产出会偏低。

二、裂解与消化操作要点

裂解与消化是释放DNA的关键步骤，核心要求是裂解充分、DNA不降解。除了在样本前处理中可以通过研磨、剪碎等方式来促进裂解一些脂肪含量较高、纤维丰富的组织外，研究者还可以选择具备足够裂解能力的裂解液，如市面上在核酸提取领域深耕多年的BIOG、Qiagen等品牌的裂解液，均拥有专利的裂解技术，可快速彻底裂解组织细胞，充分释放出核酸，具有该种性能的裂解液才可显著提升困难样本的DNA提取得率。在消化过程中，研究者可以根据样本消化难易程度，适当增加或减少消化时长，以充分消化为准，如毛囊组织，可将消化时间延长至1-2小时；鼠尾组织，有必要可进行过夜消化操作等。

三、核酸吸附操作要点

核酸吸附是柱提法DNA提取的核心步骤，直接决定了DNA的结合回收率与初始纯度，核心要求是吸附充分、结合稳定。吸附前研究者需根据试剂盒要求精准添加异丙醇、无水乙醇等，需严格按照样本裂解液体积配比添加，不可随意增减用量。醇盐浓度不足会导致DNA无法有效结合硅胶膜，造成核酸大量流失、提取得率偏低；浓度过高则会导致大量杂质非特异性吸附，降低DNA纯度。

此外，吸附柱中吸附膜的特性也十分关键，其吸附能力越强，得到的DNA产量就越高。市面上的提取试剂盒一般使用的是普通国产吸附膜，膜较厚，但对核酸的吸附能力并不显著。想要追求更高的提取得率，可以使用像BIOG品牌这类采用进口材料研发的化学修饰离子膜，膜的厚度比国产膜更薄，但对DNA的吸附更强，尤其是对于一些珍稀样本的核酸提取这点十分重要。

四、洗涤操作要点

洗涤操作是去除残留杂质、提升DNA纯度的关键步骤，核心要求是除杂彻底、核酸不脱落、无试剂残留。该步骤中，DNA可稳定结合在硅胶膜上，而组织/细胞中残留的变性蛋白、多糖、脂类、多余盐离子以及裂解液、结合液残留杂质，均可通过专用洗涤液清洗去除，洗涤效果直接决定最终DNA的纯度与下游实验可用性，如果不去除干净则可能对后续PCR、RT-qPCR等酶学反应产生严重抑制，建议实验者选用含有高效去污因子的BIOG、Qiagen等洗涤液，以彻底去除杂质，进而提升DNA的提取纯度。另外值得注意的是，洗涤操作前需确认洗涤液是否已按说明书提前补加无水乙醇，未加乙醇的洗涤液无法维持硅胶膜与DNA的结合状态，会造成DNA大量洗脱流失，导致最终产物浓度降低。洗涤液最好现配现用，以防乙醇挥发影响提取效果。

五、洗脱操作要点

洗脱操作是获取纯化基因组DNA的最终步骤，核心要求是洗脱充分、完整性高。有以下几点操作可以帮助提升最终的DNA质量：

（1）为提升困难样本、低浓度样本的洗脱效率，可将洗脱液提前预热至55-65℃，温热洗脱液能够显著弱化DNA与硅胶膜的结合力，相较于常温洗脱可有效提升基因组DNA回收浓度。

（2）加入洗脱液后不可立即离心，需室温静置2-5 min，使洗脱液充分渗透硅胶膜、充分接触结合态DNA，给予核酸充足的解离时间，这是提升洗脱效率的关键细节。

（3）根据实验需求合理控制洗脱体积，小体积洗脱可提高DNA浓度，适合微量样本；大体积洗脱可获得更高总核酸量，但会稀释浓度，可根据样本类型灵活调整。