武汉大学构建高通量结直肠癌类器官芯片，实现个体化药敏评估

三维肿瘤类器官能够较好保留患者原始肿瘤组织的遗传、转录、组织学及药物反应特征，近年来已逐渐成为肿瘤生物学研究、抗肿瘤药物筛选以及个体化治疗的重要体外模型。然而，传统类器官培养通常依赖Matrigel胶滴法（DOME）。由于类器官在胶滴中的位置、尺寸及生长状态难以精准控制，不同类器官之间容易出现明显的形态异质性，同时还存在成像焦平面不一致、类器官融合以及药物反应波动较大的问题，这些因素均会影响类器官药敏检测的标准化和重复性。

针对上述问题，武汉大学陈璞教授团队联合武汉大学中南医院等单位，开发了一种基于3D打印微孔阵列的高通量结直肠癌类器官芯片（CRCO CHIP），通过对单个类器官形成、生长和药物反应进行空间限制和原位监测，为单类器官水平的精准药敏评价提供了新的技术方案（图1）。研究成果以“High-throughput colorectal cancer organoid-on-a-chip for single-organoid-analysis-based personalized drug evaluation”为题发表于《Bio-Design and Manufacturing》。该平台可在标准96孔板体系中实现高通量类器官培养，每个培养孔中集成19个规则排列的微孔结构。

图1. 研究整体流程：从3D打印微孔阵列芯片构建到CRCO单类器官培养、原位成像与无标记药敏分析（Graphical Abstract）。

研究团队首先从微孔阵列的几何结构设计入手，对芯片进行了系统工程化优化。每个微孔具有1000 μm开口、600 μm底部直径以及500 μm高度，并采用弧形底部结构，以促进细胞向微孔底部聚集并形成单一类器官。与此同时，团队进一步结合粒子沉降、流体剪切力以及氧扩散模拟，对微孔内部的细胞聚集和微环境进行了表征。模拟结果显示，细胞可在较短时间内沉降至微孔底部，而微孔底部维持较低剪切力环境，并可随着类器官生长形成局部氧梯度。

在芯片模具加工方面，研究团队采用了摩方精密面投影微立体光刻（PμSL）技术制备。首先使用SolidWorks完成微孔阵列结构设计，随后通过摩方精密microArch®S230（精度：2μm）高精度DLP 3D打印设备对耐高温树脂（HTL）进行3D打印，获得具有复杂微尺度结构的树脂母模。打印后的母模经低黏附处理后进一步用于PDMS翻模，最终制备出可嵌入96孔板的PDMS微孔阵列芯片（图2）。该技术路线充分利用了高精度3D打印在复杂微结构快速制造方面的优势，避免了传统微纳加工在结构设计、制模周期和成本方面的限制，也为微孔阵列参数的快速迭代提供了基础。

图2. 3D打印微孔阵列芯片的设计与制备。研究采用摩方精密S230 DLP 3D打印设备制备树脂母模，并经PDMS翻模获得微孔阵列芯片。

在培养条件优化阶段，研究人员首先使用HT-29细胞确定微孔内稳定形成肿瘤球所需的最低起始细胞量。结果显示，相比50 cells/microwell，100 cells/microwell能够形成更加稳定且均一的肿瘤球。随后，在患者来源结直肠癌类器官中进一步比较2%、5%和10% Matrigel条件，最终确定100个细胞/微孔联合5% Matrigel为较优培养条件。

在这一条件下，CHIP组类器官可在培养早期形成相对独立、均一的结构，并在后续培养过程中保持良好的形态稳定性。与传统DOME培养相比，CHIP组类器官的面积、Feret直径以及圆度均表现出更低的离散程度，其形态学变异系数整体维持在较低水平。同时，芯片培养体系还减少了Matrigel的使用量，并有效避免传统胶滴培养中常见的类器官随机融合现象，为单个类器官连续追踪提供了基础（图3）。

图3. CHIP与DOME培养下CRCO的形成、均一性及活性比较。CHIP可实现规则、独立的单类器官培养，并降低形态学变异。

除了形态学均一性，研究团队还进一步评价了CHIP培养类器官的病理学和分子表型。H&E及免疫组化结果显示，CHIP和DOME培养的CRCOs均能够保留与原始肿瘤组织相似的结构特征，并表达CK20、Ki67等相关标志物。进一步的全类器官免疫荧光分析显示，CHIP培养的类器官保留了CK20、MUC2、CDX2、β-catenin等结直肠上皮及肿瘤相关特征。值得注意的是，CHIP组CD44表达水平较高，提示其微环境可能更有利于部分肿瘤干性表型的维持（图4）。

图4. CRCOs的表征。

在此基础上，研究人员进一步评估了该芯片在个体化药物敏感性检测中的应用潜力。研究选取患者来源CRCO，对5-氟尿嘧啶（5-FU）和瑞戈非尼进行药物处理，并同时采用传统终点活性检测和基于类器官面积变化的无标记形态学分析。由于CHIP能够将单个类器官限制在固定微孔内，研究人员可以连续追踪同一类器官的面积和形态变化，从而避免DOME培养中由于类器官位置变化、融合以及尺寸差异带来的干扰。

进一步结果显示，CHIP平台能够获得更加稳定的药物剂量-反应曲线，并支持对IC50进行定量分析。研究还将基于类器官面积变化得到的IC50与CellTiter-Glo 3D检测结果进行比较。在CHIP平台中，两种检测方式获得的结果具有较好一致性，而传统DOME培养中两种方法之间存在更明显差异，说明规则、均一并且可原位成像的单类器官培养模式有望提高无标记形态药敏分析的可靠性（图5）。

图5. CHIP与DOME条件下5-FU和瑞戈非尼药物敏感性分析及IC50比较，展示平台在无标记形态学药敏评价中的应用潜力。

相比传统胶滴培养方式，该CRCO CHIP的一个重要特点在于将高精度制造、标准化类器官培养和单类器官分析进行了整合。通过3D打印快速制造具有特定几何结构的微孔阵列，使每一个类器官都能够在相对独立且可定位的微环境中形成，从而提高了类器官培养的一致性，并为后续自动化显微成像、无标记动态监测以及高通量药敏分析创造了条件。

此外，该平台能够在较低起始细胞量条件下开展类器官构建，对于临床活检等样本量有限的场景具有潜在优势。文章提出，未来还可进一步将该平台与人工智能图像分析技术结合，对类器官收缩、膜起泡等动态表型进行高内涵分析，并进一步扩展至自动化和规模化的个体化药物筛选。

总结：本研究利用摩方精密微纳3D打印技术完成微孔阵列树脂母模的高精度制造，并进一步构建了适配标准96孔板的CRCO CHIP。该平台实现了低起始细胞量条件下的单类器官形成、规则化空间定位和原位连续观察，并在结直肠癌类器官药敏评价中表现出良好的重复性和应用潜力。研究展示了高精度3D打印与类器官工程结合在精准肿瘤模型构建和个体化药物筛选中的应用价值，也为未来自动化、高通量类器官分析平台的开发提供了新的技术路径。

https://doi.org/10.1631/bdm.2500478

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