J Pharm Anal｜960种天然产物高通量筛出牛蒡子苷元：精准靶向KEAP1-S602，激活NRF2抗氧化/抗铁死亡通路缓解多柔比星心脏毒性！(孙宁团队)

2026年8月7日，江南大学无锡医学院孙宁、杨海团队联合江南大学附属医院及无锡市锡山人民医院，在Journal of Pharmaceutical Analysis （中科院1区，IF=11.2）在线发表题为“Arctigenin discovered by high-throughput screening ameliorates doxorubicin-induced cardiotoxicity as a novel natural KEAP1-NRF2 inhibitor”的原创研究论文。论文于2025年7月14日投稿，2026年3月7日修回，3月9日接收，3月10日在线发表。Ning Sun和Hai Yang为通讯作者。

研究聚焦多柔比星（doxorubicin，DOX）诱导的心脏毒性这一肿瘤治疗中的重要限制因素。研究者建立以心肌细胞ATP水平为读出的高通量筛选体系，从960种天然产物中筛选出13种可使DOX处理后ATP水平提高25%以上的候选化合物，其中来自牛蒡（Arctium lappa L.）的天然木脂素类成分牛蒡子苷元（arctigenin，ATG）表现出最显著的心肌保护活性。随后，研究通过H9C2细胞、人胚胎干细胞来源心肌细胞（hESC-CMs）以及慢性DIC小鼠模型，系统证实ATG能够减轻心肌细胞死亡、氧化应激、脂质过氧化和铁死亡，同时保护线粒体结构及心功能。

机制研究进一步利用生物素化ATG pull-down、LC-MS/MS、分子对接、细胞热位移分析（CETSA）、药物亲和响应靶标稳定性分析（DARTS）、表面等离子体共振（SPR）以及位点突变等技术，锁定Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）为ATG的直接靶蛋白。ATG能够特异性结合KEAP1的丝氨酸602（S602）位点，竞争性破坏KEAP1-NRF2相互作用，减少NRF2泛素化和蛋白降解，促进NRF2核转位，进而激活抗氧化反应元件（ARE）及GPX4、SLC7A11、NQO1和HMOX1等下游抗氧化、抗铁死亡基因。S602A突变后，ATG与KEAP1的结合能力及心肌保护作用均明显减弱。

这项研究由此提出了一条较为完整的“ATG-KEAP1(S602)-NRF2-ARE”心肌保护机制，并将牛蒡子苷元界定为一种天然KEAP1-NRF2蛋白-蛋白相互作用抑制剂，为从天然产物中开发针对蒽环类药物心脏毒性的候选干预分子提供了新的实验依据。

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【摘 要】

多柔比星（doxorubicin，DOX）是一种广泛应用的化疗药物，但其临床应用受到剂量依赖性心脏毒性的显著限制。这种心脏毒性主要表现为氧化应激、线粒体功能障碍和铁死亡。尽管相关研究已开展数十年，右雷佐生（dexrazoxane，DXZ）仍是目前获批用于心脏保护的主要药物，但其临床应用受到可能影响抗肿瘤疗效以及产生全身毒性等因素的限制，因此亟需寻找有效的替代方案。

本研究通过高通量筛选包含960种化合物的天然产物库，鉴定出牛蒡子苷元（arctigenin，ATG）。ATG是亚洲药用植物牛蒡（Arctium lappa L.）中的主要活性成分之一，并被确定为对抗DOX诱导心脏毒性（DOX-induced cardiotoxicity，DIC）的潜在心脏保护候选化合物。

体外和体内实验均显示，ATG能够显著减轻DOX诱导的细胞死亡，减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）积聚，抑制铁死亡，维持线粒体功能，并改善小鼠心功能和心肌组织结构。

机制研究发现，ATG通过结合Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，KEAP1）的丝氨酸602（S602）残基，竞争性抑制KEAP1与核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2）之间的相互作用，从而激活NRF2-抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）通路。

这种结合促进NRF2从KEAP1复合物中解离，降低NRF2泛素化水平，增加NRF2在细胞核中的积聚，并增强下游靶基因的转录。

综上，本研究鉴定出ATG是一种新型NRF2激活剂，可通过直接靶向KEAP1-NRF2-ARE轴，抑制氧化应激和铁死亡，从而缓解DIC。

01

研究背景及科学问题

多柔比星（DOX）是治疗多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤的重要化疗药物，具有显著的抗肿瘤活性。然而，其临床应用受到明显的剂量依赖性心脏毒性限制，可逐渐导致心室扩张、心肌纤维化，最终甚至发展为心力衰竭。

因此，深入理解DOX诱导心脏毒性（DIC）的发生机制，对于改善肿瘤患者治疗结局具有重要意义。目前针对DOX心脏毒性的有效防治手段仍较有限。右雷佐生（DXZ）是目前获批应用的心脏保护药物，但已有研究提示，高剂量应用可能伴随肝毒性、骨髓抑制等不良作用，并可能影响化疗疗效。因此，开发新的低毒性DIC心脏保护剂仍具有现实需求。

DIC的具体机制尚未被完全阐明。目前认为，其发生涉及氧化应激、线粒体损伤、铁死亡以及拓扑异构酶抑制等多个过程。

其中，氧化应激被认为是重要的启动因素。DOX分子中的醌结构可经酶促还原生成半醌，随后迅速将未配对电子转移给氧分子，产生大量超氧阴离子自由基。与此同时，DOX由于对线粒体内膜磷脂具有较高亲和力，可选择性蓄积于心肌细胞线粒体，破坏呼吸链及电子传递过程，进一步放大ROS生成。

此外，DOX与铁形成的复合物还可以参与氧化还原循环并产生氧自由基。大量ROS可氧化损伤脂质、蛋白质和DNA，破坏细胞膜及线粒体完整性，最终导致心肌细胞死亡。

近年来，铁死亡（ferroptosis）被认为是DIC中的重要细胞死亡方式。铁死亡是一种铁依赖、脂质过氧化驱动的调控性细胞死亡形式。因此，同时针对氧化应激和铁死亡进行干预，可能成为缓解DIC的重要策略。

KEAP1-NRF2是细胞抵抗内源性和外源性损伤的重要防御通路。在非应激状态下，NRF2主要位于细胞质中，并通过与抑制蛋白KEAP1及Cullin 3 E3泛素连接酶复合物相互作用而持续被标记并降解。

当细胞受到应激或ROS水平升高时，NRF2泛素化减少并得到稳定，随后转位进入细胞核，与靶基因调控区域内的抗氧化反应元件（ARE）结合，促进多种维持氧化还原稳态基因的表达，包括醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素加氧酶1（HMOX1/HO-1）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）等。因此，维持NRF2信号通路活性对于抵御DIC具有重要意义。

基于此，研究者建立天然产物高通量筛选体系，从960种天然产物中寻找能够抑制DOX诱导心肌细胞死亡的候选化合物，并最终筛选出牛蒡子苷元（ATG）。

随后，研究分别在人胚胎干细胞来源心肌细胞（hESC-CMs）、H9C2细胞以及DIC小鼠模型中验证ATG的作用。更进一步，研究证明ATG可直接结合KEAP1 Kelch结构域的S602位点，竞争性抑制KEAP1-NRF2相互作用，降低NRF2泛素化和蛋白酶体降解，促进NRF2核转位并激活GPX4、SLC7A11、NQO1和HMOX1等抗氧化、抗铁死亡基因，从而减轻DOX诱导的心肌损伤。

02

重要发现及亮点

高通量筛选960种天然产物，牛蒡子苷元表现出最强的心肌细胞保护活性

研究者首先建立以H9C2心肌细胞ATP生成量为检测指标的96孔板高通量筛选体系。H9C2细胞接受1 μM DOX处理，同时分别加入天然产物库中的960种化合物，每种化合物浓度为10 μM。

初筛共鉴定出13种能够使DOX处理后ATP生成量提高25%以上的候选化合物。其中，ATG表现出最强且较稳定的保护作用，因此被选为后续研究对象。

进一步的剂量实验显示，ATG自身对H9C2细胞的毒性较低，半数抑制浓度（IC50）为420.3±2.94 μM，明显高于高通量筛选中使用的10 μM。

CCK-8及ATP检测显示，在20 μM以内，ATG能够剂量依赖性减轻DOX造成的细胞活力下降和ATP减少。Calcein-AM/PI双染进一步证实，ATG可提高活细胞比例并减少DOX诱导的细胞死亡。同时，ATG提高抗凋亡蛋白BCL2表达，并降低促凋亡蛋白BAX表达。

图1：高通量筛选鉴定牛蒡子苷元（ATG）为抵抗多柔比星（DOX）诱导心肌细胞（CM）死亡的有效保护剂。（A）筛选流程：H9C2细胞接受1 μM DOX联合960种天然产物库中的化合物处理，每种天然产物浓度为10 μM，处理24 h，采用CellTiter-Glo法检测三磷酸腺苷（ATP）生成。（B）共有13种候选化合物相较DOX组使ATP生成量提高≥25%，其中ATG显示出最强的细胞保护作用。（C）ATG化学结构。（D）ATG剂量依赖性细胞毒性，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测，n=4。（E）不同浓度ATG对DOX诱导细胞死亡的保护作用，采用CCK-8检测，n=4。（F）ATG抑制DOX诱导的ATP生成下降，n=4。（G）Calcein-AM/碘化丙啶（PI）染色代表图，n=4。（H、I）H9C2细胞中Calcein-AM（H）和PI（I）荧光强度定量，n=4。（J、K）BCL2相关X蛋白（BAX）、B细胞淋巴瘤2（BCL2）和β-actin（ACTB）的代表性Western blot图（J）及定量结果（K），n=3。数据以均值±标准误（SEM）表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。统计学显著性采用非配对双侧t检验以及单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验进行评价。DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组。

ATG在人胚胎干细胞来源心肌细胞中同样减轻DOX诱导的心脏毒性

考虑到H9C2细胞与人心肌细胞在功能和生理特征上存在差异，研究者进一步建立人胚胎干细胞H7来源的心肌细胞模型。

研究在MYL2基因最后一个外显子后插入新霉素筛选盒，建立MYL2Neo/WT-H7细胞，并经心肌定向分化和G418筛选后获得纯度超过98%的hESC-CMs。

ATG在hESC-CMs中的自身毒性同样较低，IC50为465.6±3.68 μM。研究进一步调整细胞密度及DOX浓度，使DOX处理24 h后约产生50%的细胞死亡。

CCK-8、ATP及乳酸脱氢酶（LDH）释放实验显示，DOX明显降低细胞活力和ATP水平，并增加LDH释放，而ATG可剂量依赖性减轻上述变化。

Calcein-AM/PI染色同样显示ATG明显抑制DOX诱导的hESC-CMs死亡。此外，ATG可恢复BCL2表达并抑制BAX表达。由此证实，ATG在人源心肌细胞模型中也具有明显的保护作用。

图2：牛蒡子苷元（ATG）对多柔比星（DOX）诱导的人胚胎干细胞来源心肌细胞（hESC-CMs）心脏毒性的保护作用。（A）化学成分明确的人胚胎干细胞心肌定向分化方案。（B）ATG剂量依赖性细胞毒性，采用CCK-8检测，n=4。（C）DOX剂量依赖性细胞毒性，0.5–20 μM，处理24 h，采用CCK-8检测，n=4。（D）ATG保护细胞免受DOX诱导的死亡，采用CCK-8检测，n=4。（E）ATG抑制DOX诱导的ATP生成下降，n=4。（F）ATG减少DOX诱导的LDH释放，n=4。（G）Calcein-AM（活细胞，绿色）/PI（死细胞，红色）染色代表图，n=4。（H、I）hESC-CMs中Calcein-AM（H）和PI（I）荧光强度定量，n=4。（J、K）BAX、BCL2和ACTB的代表性Western blot图（J）及定量结果（K），n=3。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。统计学显著性采用单因素ANOVA结合Tukey事后检验进行评价。DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组。

ATG改善慢性DIC小鼠心功能和心肌结构损伤

为验证体内作用，研究采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠建立慢性DIC模型。DOX按5 mg/kg/周腹腔注射，连续4周。ATG低、高剂量分别为20和40 mg/kg，经口给予；DXZ 50 mg/kg/周作为阳性对照。

DOX显著降低小鼠摄食量，而ATG可缓解这一变化。高分辨率超声心动图显示，DOX显著降低左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）；ATG能够明显改善上述心功能指标，其保护作用与DXZ相近。

DOX还可导致心脏萎缩及心重/胫骨长度（HW/TL）比值降低，而ATG和DXZ均可减轻这种变化。

血清学检测显示，DOX导致肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）和LDH升高，ATG和DXZ均可显著抑制其增加。

H&E和Masson染色显示，DOX小鼠出现心肌排列紊乱、血管周围纤维化及间质纤维化，而ATG处理后上述病理改变明显改善。此外，ATG降低BAX、提高BCL2，并降低BAX/BCL2比值。

图3：牛蒡子苷元（ATG）对多柔比星（DOX）诱导小鼠心脏毒性的保护作用。（A）实验时间线，包括药物给药、超声心动图检测和组织采集。（B）平均摄食量统计分析，n=8。（C）心脏大体形态代表图，n=8；M型超声心动图代表图，n=8；苏木精-伊红（H&E）染色和Masson三色染色代表图，n=6。（D、E）左心室射血分数（LVEF，D）和左心室短轴缩短率（LVFS，E）统计分析，n=8。（F）心重（HW）/胫骨长度（TL）比值统计，n=8/组。（G、H）小鼠血清肌酸激酶MB同工酶（CK-MB，G）和乳酸脱氢酶（LDH，H）水平，n=8。（I）心肌纤维化面积定量，n=6。（J–M）BAX/BCL2/ACTB代表性Western blot图（J）、BAX定量（K）、BCL2定量（L）及BAX/BCL2比值（M），n=6。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。统计学显著性采用单因素ANOVA结合Tukey事后检验进行评价。CON：对照组；DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组。

ATG通过重塑转录程序增强抗氧化防御并抑制铁死亡

为解析ATG发挥心肌保护作用的分子基础，研究者对DOX单独处理和DOX+ATG处理的hESC-CMs进行了RNA测序。

主成分分析显示两组形成明显不同的转录聚类。DOX+ATG组与DOX组之间共鉴定出6361个差异表达基因，其中3759个上调、2602个下调。

KEGG富集分析显示，这些差异基因涉及氧化磷酸化、ROS稳态、铁死亡、NOD样受体信号以及细胞色素P450代谢等通路。火山图进一步显示，ATG可上调Hmox1、Nqo1、Gpx4和Slc7a11等保护性基因。

GSEA分析进一步支持ATG对氧化应激和铁死亡相关基因集合的调控作用。RT-qPCR结果显示，ATG能够恢复DOX抑制的ROS解毒相关基因Hmox1、Nrf2、Sod1、Sod2、Gclc、Gclm以及抗铁死亡相关基因Gpx4和Slc7a11的表达。

这些结果提示，ATG可从转录层面逆转DOX造成的抗氧化防御和铁死亡抑制程序受损。

图4：牛蒡子苷元（ATG）通过调节活性氧（ROS）和铁死亡保护机体免受多柔比星（DOX）诱导的心脏毒性（DIC）。（A）DOX组与ATG组的主成分分析（PCA）。（B、C）差异表达基因（DEGs）：柱状图（B）和热图（C）。（D）DEGs的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。（E）转录组分析火山图。（F、G）基因集富集分析（GSEA）显示ATG抑制ROS相关反应（F）和铁死亡（G）。（H）ROS及铁死亡相关基因mRNA表达，n=3。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。统计学显著性采用单因素ANOVA结合Tukey事后检验评价。FC：倍数变化；Hmox1：血红素加氧酶1；Nrf2：核因子E2相关因子2；Gpx4：谷胱甘肽过氧化物酶4；Nqo1：NAD(P)H醌脱氢酶1；Slc7a11：溶质载体家族7成员11；Acsl4：长链脂酰辅酶A合成酶4；Sod1：超氧化物歧化酶1；Sod2：超氧化物歧化酶2；Gclc：谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基；Gclm：谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基；CON：对照组；DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组。

ATG在人体心肌细胞中抑制氧化应激和铁死亡并保护线粒体

在hESC-CMs中，DOX处理导致SOD活性和谷胱甘肽（GSH）含量显著下降，而脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）增加。ATG可剂量依赖性恢复SOD和GSH，并降低MDA。

DOX还显著增加细胞内ROS和线粒体ROS（mitoROS），而ATG可明显抑制两者积聚。C11-BODIPY流式细胞术显示，ATG同样能够显著减少DOX诱导的脂质过氧化。

JC-1检测显示，DOX破坏线粒体膜电位，表现为绿色单体相对红色聚集体增加；ATG处理能够明显恢复线粒体膜电位。透射电子显微镜进一步显示，ATG可减轻DOX诱导的线粒体嵴密度下降和嵴结构变形。

机制上，DOX降低NRF2、磷酸化NRF2（p-NRF2）及其下游NQO1、HO-1、GPX4和SLC7A11蛋白表达，同时上调促进脂质过氧化的ACSL4。ATG可逆转上述改变，提示其能够激活KEAP1-NRF2-ARE信号，增强抗氧化并抑制铁死亡。

图5：牛蒡子苷元（ATG）改善多柔比星（DOX）诱导的人胚胎干细胞来源心肌细胞（hESC-CMs）氧化应激和铁死亡。（A–C）超氧化物歧化酶（SOD，A）、谷胱甘肽（GSH，B）和丙二醛（MDA，C）水平，n=4。（D、E）MitoSOX染色代表图（D）及线粒体ROS（mitoROS）定量（E），n=6。（F、G）采用流式细胞术检测脂质ROS生成（F）及定量分析（G），n=3。（H）电子显微镜观察线粒体超微结构。（I–K）铁死亡相关标志物代表性Western blot图（I）；NRF2、磷酸化NRF2（p-NRF2）和长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）的定量分析（J）；SLC7A11、血红素加氧酶1（HO-1）、NAD(P)H醌脱氢酶1（NQO1）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的定量分析（K），n=3。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。统计学显著性采用单因素ANOVA结合Tukey事后检验评价。ACTB：β-actin；DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组。

ATG在DIC小鼠体内激活NRF2-ARE并抑制心肌铁死亡

在DIC小鼠中，DOX显著提高MDA水平，同时降低SOD活性和GSH含量。ATG可显著降低MDA，并恢复SOD和GSH。

由于过量ROS可促进脂质过氧化并产生4-羟基壬烯醛（4-HNE）等有毒产物，研究进一步采用免疫组化检测4-HNE。结果显示，DOX显著增加心肌4-HNE，而ATG可明显抑制这种积聚。

RT-qPCR显示，DOX降低Nrf2、Hmox1、Nqo1、Slc7a11和Gpx4表达，并提高Acsl4；ATG则可明显逆转这些转录变化。Western blot结果进一步证实DOX抑制NRF2、HO-1、NQO1、SLC7A11和GPX4，同时增加ACSL4，而ATG可恢复相应蛋白表达。

免疫组化进一步显示，ATG增加p-NRF2并促进其核积聚，同时恢复SLC7A11和GPX4表达。由此表明，ATG在体内同样通过激活NRF2-ARE轴减轻心肌氧化应激和铁死亡。

图6：牛蒡子苷元（ATG）抑制多柔比星（DOX）诱导的小鼠氧化应激和铁死亡。（A–C）丙二醛（MDA，A）、超氧化物歧化酶（SOD，B）和谷胱甘肽（GSH，C）水平，n=6。（D、E）4-羟基壬烯醛（4-HNE）免疫组化（IHC）代表图（D）及定量（E），n=6。（F）铁死亡相关mRNA表达，n=6。（G、H）铁死亡调控蛋白代表性Western blot图（G）及定量（H），n=6。（I–K）磷酸化NRF2（p-NRF2，I）、SLC7A11（J）和GPX4（K）的IHC代表图及定量，n=6。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。统计学显著性采用单因素ANOVA结合Tukey事后检验评价。NRF2：核因子E2相关因子2；HO-1：血红素加氧酶1；NQO1：NAD(P)H醌脱氢酶1；ACTB：β-actin；IOD：积分光密度；CON：生理盐水处理组；DOX：DOX处理组；LATG：20 mg/kg ATG处理组；HATG：40 mg/kg ATG处理组。

化学蛋白质组学锁定KEAP1为ATG的直接结合靶点

为了寻找ATG的直接分子靶点，研究者合成生物素化ATG探针，并从心肌细胞裂解液中通过亲和纯化捕获ATG结合蛋白，随后进行LC-MS/MS分析。

ATG-biotin仍保留与未修饰ATG相当的细胞保护能力。Pull-down和考马斯亮蓝染色显示，在约70 kDa位置出现明显蛋白条带。LC-MS/MS鉴定出多个候选蛋白，包括KEAP1、异质性核核糖核蛋白L（HNRNPL）、drebrin（DBN1）、核纤层蛋白B受体（LBR）和脆性X信使核糖核蛋白1（FMR1）。

分子对接预测显示，KEAP1具有最优的候选结合能。Pull-down联合Western blot进一步验证ATG与KEAP1结合，未标记ATG还能够剂量依赖性竞争ATG-biotin对KEAP1的捕获。

内源性和外源性CETSA均显示，ATG能够提高KEAP1热稳定性。SPR进一步证实ATG与纯化KEAP1直接结合，其平衡解离常数KD为22.0 μM。

在KEAP1稳定敲低的H9C2和AC16细胞中，KEAP1敲低本身即可明显减轻DIC；而在此基础上加入ATG，细胞活力、ATP生成和LDH释放均未获得进一步明显改善。这表明ATG的心肌保护效应具有明显的KEAP1依赖性。

图7：鉴定Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）为牛蒡子苷元（ATG）的结合蛋白。（A）ATG-biotin的化学结构。（B）基于生物素辅助pull-down和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析捕获靶蛋白的示意图。（C）在人胚胎干细胞来源心肌细胞（hESC-CMs）中采用ATG-biotin（100 μM）进行pull-down。（D、E）采用细胞热位移分析（CETSA）检测ATG-KEAP1相互作用：hESC-CM裂解液接受ATG 100 μM处理2 h进行外源结合检测（D）；完整hESC-CMs接受ATG 30 μM处理12 h进行内源结合检测（E），n=3。（F）SPR分析ATG与KEAP1之间的相互作用，KD=22 μM。（G–I）在Keap1敲低细胞中，ATG的细胞保护作用消失，分别检测细胞活力（G）、ATP生成（H）和LDH释放（I），n=4。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，****P<0.0001；ns表示差异无统计学意义。统计学显著性采用非配对双侧t检验和单因素ANOVA结合Tukey事后检验评价。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；KEAP1：Kelch样ECH相关蛋白1；DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组。

ATG结合KEAP1的S602位点，抑制NRF2泛素化并促进其核转位

Co-IP显示，ATG能够降低H9C2细胞中KEAP1与NRF2之间的相互作用。进一步实验发现，ATG减少NRF2泛素化，并在加入蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）后减慢NRF2蛋白降解速度。

与此同时，ATG促进NRF2向细胞核转位并激活下游ARE。

分子对接预测表明，ATG与KEAP1结合时可形成两个氢键，其中涉及S602和谷氨酰胺530（Q530）残基。

为验证具体位点，研究分别构建KEAP1野生型以及S602A、Q530E突变体。DARTS结果显示，S602A突变几乎消除了ATG的结合保护作用，而Q530E突变影响较小，提示S602为关键结合位点。

CETSA同样显示，相比野生型KEAP1，ATG无法有效提高KEAP1-S602A突变体的热稳定性。

SPR进一步显示，ATG与KEAP1-S602A突变体的KD升高至5300 μM，相比野生型KEAP1的22 μM，结合亲和力大幅下降。对Kelch结构域其他丝氨酸位点进行检测后，也未发现类似结合，进一步支持ATG对S602位点的相对特异性。

综合来看，ATG通过直接结合KEAP1-S602，破坏KEAP1-NRF2相互作用，降低NRF2泛素化与降解，促进NRF2核转位，并激活抗氧化及抗铁死亡基因。

图8：牛蒡子苷元（ATG）通过与核因子E2相关因子2（NRF2）竞争结合Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）而激活NRF2。（A）免疫共沉淀（IP）检测ATG破坏KEAP1-NRF2结合，n=3。（B）ATG降低NRF2泛素化，n=3。（C）ATG延长NRF2蛋白半衰期，环己酰亚胺（CHX）100 μg/mL，n=3。（D）ATG增加细胞核NRF2，n=3。（E）采用双荧光素酶报告实验检测ATG对抗氧化反应元件（ARE）的激活作用，n=4。（F）ATG-KEAP1分子对接。（G）转染野生型（WT）、Q530E突变型和S602A突变型pCDH-Flag-KEAP1质粒的HEK-293T细胞裂解液，与或不与ATG 100 μM孵育2 h，随后加入100 μg/mL pronase处理，n=3。（H、I）转染WT和S602A突变型pCDH-Flag-KEAP1质粒的HEK-293T细胞裂解液，与或不与ATG 100 μM孵育2 h，随后接受逐步升高温度处理，n=3；展示免疫印迹结果（H）及热变性曲线定量（I）。（J）SPR检测ATG与KEAP1S602A突变体的相互作用，KD=5300 μM。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。统计学显著性采用单因素ANOVA结合Tukey事后检验评价。HA：人流感血凝素标签；ACTB：β-actin；H3：组蛋白H3；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；NRF2：核因子E2相关因子2；DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组；Q530E：KEAP1第530位谷氨酰胺突变为谷氨酸；S602A：KEAP1第602位丝氨酸突变为丙氨酸。

KEAP1-S602是ATG发挥细胞保护作用所必需的关键位点

为了验证S602是否真正决定ATG的功能，研究者在KEAP1稳定敲低的H9C2和AC16细胞中重新表达野生型KEAP1或S602A突变型KEAP1，建立稳定回补细胞系。

与野生型相比，在表达S602A突变型KEAP1的细胞中，ATG对DOX诱导细胞死亡的保护作用明显减弱。

此外，ATG无法有效抑制S602A突变细胞中的DOX诱导mitoROS积聚，也不能有效激活NRF2信号及恢复NRF2、SLC7A11、HO-1、NQO1、GPX4等蛋白，同时其对ACSL4的调控作用受到明显削弱。

图9：Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）的丝氨酸602（S602）位点是牛蒡子苷元（ATG）介导细胞保护作用所必需的关键位点。（A）将Keap1WT和Keap1S602A重新导入稳定敲低Keap1的H9C2和AC16细胞。（B）在表达KEAP1S602A的H9C2及AC16细胞中，ATG的保护作用被消除，采用CCK-8检测，n=4。（C、D）MitoSOX染色代表图（C）和线粒体ROS（mitoROS）定量（D），n=6。（E–G）铁死亡相关标志物代表性Western blot图（E）；H9C2细胞中NRF2、ACSL4、SLC7A11、HO-1、NQO1和GPX4定量（F）；AC16细胞中NRF2、ACSL4、SLC7A11、HO-1、NQO1和GPX4定量（G），n=3。数据以均值±SEM表示。*P<0.05，****P<0.0001；ns表示差异无统计学意义。统计学显著性采用单因素ANOVA结合Tukey事后检验评价。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；ACTB：β-actin；DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组。

心脏特异性S602A突变进一步证实ATG的体内保护作用依赖KEAP1-S602

研究随后利用心脏特异性AAV9，在小鼠心脏中过表达野生型KEAP1或无法正常结合ATG的KEAP1-S602A突变体，再评价ATG对DIC的作用。

Western blot证实两种KEAP1均成功在心脏中过表达。与野生型KEAP1组相比，在S602A突变背景下，ATG改善HW/TL比值的作用消失，血清CK-MB和LDH也未出现显著下降。

超声心动图显示，ATG仅在野生型KEAP1组中有效保护LVEF和LVFS。H&E和Masson染色进一步显示，在S602A突变组中，ATG改善心肌结构紊乱、血管周围和间质纤维化的作用也明显减弱。

因此，体内实验进一步支持：ATG对DIC的心肌保护作用高度依赖其与KEAP1-S602位点的结合。

图10：Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）的丝氨酸602（S602）位点是牛蒡子苷元（ATG）在小鼠中发挥心脏保护作用所必需的关键位点。（A）实验时间线，包括腺相关病毒9型（AAV9）注射、药物给药、超声心动图检测及组织采集。（B）注射AAV9-scr、Keap1WT或Keap1S602A的小鼠心脏中KEAP1代表性Western blot及定量，n=8。（C）平均摄食量统计分析，n=8。（D）心重（HW）/胫骨长度（TL）比值统计分析，n=8。（E、F）小鼠血清LDH（E）和CK-MB（F）水平，n=8。（G）心脏大体形态代表图，n=8；M型超声心动图代表图，n=8；H&E和Masson三色染色代表图，n=6。（H、I）LVEF（H）和LVFS（I）统计分析，n=8。（J）心肌纤维化面积定量，n=6。数据以均值±SEM表示。**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；ns表示差异无统计学意义。统计学显著性采用单因素ANOVA结合Tukey事后检验评价。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；DOX：DOX处理组；ATG：ATG处理组。

【贡献】★★★★★

综上，本研究证实，牛蒡子苷元（ATG）在细胞和小鼠DIC模型中均表现出显著的干预作用。

机制上，ATG通过直接结合KEAP1的丝氨酸602（S602）位点激活NRF2信号，进而破坏KEAP1-NRF2相互作用，促进NRF2介导的抗氧化和抗铁死亡反应。

这些结果提示，ATG可能为DIC以及其他与氧化应激和铁死亡相关的心脏疾病提供一种新的干预策略。

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