Science Advances | 四川大学林宏辉/席德慧团队揭示转录因子TOE3同时促进烟草生长和抗病毒防御的新机制

近日，四川大学生命科学学院林宏辉教授/席德慧教授团队在Science Advances发表了题为A transcription factor TOE3 simultaneously promotes growth and antiviral immunity by disrupting ABA core module in tobacco的研究论文。植物免疫激活常伴随生长抑制，这一“生长-防御权衡”长期困扰作物育种。尽管此前该团队已发现AP2转录因子TOE3能同时促进烟草生长和抗病毒防御，但其背后的分子机制一直是个谜。在这项研究中，团队锁定TOE3蛋白的N端结构域（T3N），发现它能够结合ABA受体PYL4，干扰PYL4与PP2C4的结合——相当于在ABA信号通路的源头“拆掉”了一个核心组件。更巧妙的是，当TMV侵染时，T3N发生磷酸化修饰，与PYL4的结合力大幅增强，从而进一步放大对ABA信号的抑制效果。这一发现揭示了一个由TOE3介导的、通过“劫持”ABA核心模块来解偶联GDT的全新机制，为培育兼具强生长和高抗病毒能力的作物品种提供了新策略。

研究团队首先对野生型和NtTOE3敲除烟草的转录组数据进行分析，发现在NtTOE3敲除植株中下调表达的基因显著富集于“ABA激活信号通路”和“ABA刺激细胞应答”等条目。RT-qPCR验证显示，CR-TOE3植株中ABA响应基因的表达水平显著高于野生型。种子萌发实验进一步表明，NtTOE3过表达植株在含ABA的培养基上萌发率更高，而敲除植株则对ABA更加敏感。通过酵母双杂交、双分子荧光互补、分裂荧光素酶互补和体外pull-down等多种实验，团队证实TOE3的N端结构域（T3N）与ABA受体PYL4存在物理互作。在烟草和本氏烟中，T3N均能与PYL4结合并抑制ABA响应基因的表达。

图1：TOE3通过N端结构域与ABA受体PYL4互作并抑制ABA信号

为探究ABA信号在生长与抗病毒中的功能，团队用外源ABA处理烟草和本氏烟，发现植株鲜重和株高显著降低，TMV侵染后病毒外壳蛋白积累量大幅上升，病斑更严重。而用ABA合成抑制剂氟啶酮处理后，植株生长更旺盛，病毒积累显著减少。在此基础上，团队构建了NtT3N过表达烟草株系，发现T3N-OE植株在30天时鲜重和株高均显著高于野生型，TMV侵染后病毒积累量更低、病斑更轻。相比之下，CR-TOE3植株生长受抑且更感病。RT-qPCR显示，T3N-OE植株中ABA响应基因NtABF4和NtRAB18的表达被显著下调。

图2：T3N过表达抑制ABA信号从而促进烟草生长和抗病毒免疫

团队进一步构建了NtPYL4过表达和CRISPR-Cas9敲除的烟草株系。30天时PYL4-OE植株鲜重和株高显著低于野生型，而CR-PYL4植株则显著高于野生型。TMV侵染后，PYL4-OE植株病斑更重、病毒积累更多，CR-PYL4则相反。在本氏烟中沉默NbPYL4同样促进了生长并降低了病毒积累。遗传杂交实验表明，CR-PYL4 CR-TOE3双突变体的生长和抗病表型介于CR-PYL4和CR-TOE3之间，说明NtTOE3在NtPYL4上游发挥作用。

图3：PYL4过表达激活ABA响应并抑制烟草生长、促进病毒感染

鉴于PP2C4是ABA信号通路中受PYL调控的核心组分，团队检测了NtPYL4与NtPP2C4的互作。通过CRISPR-Cas9敲除NtPP2C4后发现，CR-PP2C4植株生长受抑且TMV感染后症状更严重。遗传分析显示，CR-PYL4 CR-PP2C4双突变体的生长和抗病表型与CR-PP2C4单突变体无显著差异，表明PP2C4在PYL4下游发挥作用。在本氏烟中，过表达NbPP2C4可降低病毒积累，而共表达NbPYL4则逆转了这一效应。基于T3N和PP2C4都能结合PYL4这一发现，团队假设T3N可能通过竞争性结合来干扰PYL4-PP2C4互作。分裂荧光素酶互补实验证实，T3N的加入显著降低了PYL4与PP2C4的结合信号。微量热泳动实验定量显示，T3N与PYL4的解离常数（Kd）约为3.5 nM，而PP2C4与PYL4在无ABA时的Kd约为1061.7 nM——T3N对PYL4的亲和力比PP2C4高出约300倍。在ABA存在下，50 nM T3N即可将PYL4-PP2C4的Kd从130.48 nM提升至505.82 nM，200 nM T3N则完全阻断二者互作。然而，在CR-PP2C4背景下过表达T3N并不能完全拯救突变体的生长和感病表型。

为检验磷酸化是否影响T3N与PYL4的结合，团队构建了磷酸化模拟突变体T3Nᴰᴰ和非磷酸化突变体T3Nᴬᴬ。分裂荧光素酶互补和体外pull-down实验均显示，T3Nᴰᴰ与PYL4的结合信号显著强于野生型T3N，而T3Nᴬᴬ的结合信号则明显减弱。在体内竞争中，T3Nᴰᴰ对PYL4-PP2C4互作的干扰效果最强。团队进一步构建了T3Nᴰᴰ-OE和T3Nᴬᴬ-OE烟草株系，发现T3Nᴰᴰ-OE植株生长更旺盛、病毒积累更少，而T3Nᴬᴬ-OE则与野生型无显著差异。

图5：T3N磷酸化增强其与PYL4的结合并放大对ABA核心模块的干扰

四川大学生命科学学院博士后焦博雷和博士研究生吴柏君为共同第一作者，四川大学在读研究生方浩楠、蒋家乐、麦钟月，云南烟科院姜宁参与了相关工作，林宏辉教授为本研究提供了重要指导。该研究获得了国家自然科学基金的资助。