【Nat Met】沉默术士！斯坦福大学丁燕萍院士团队开发新型元件LATeNT以实现时空选择性突触沉默

撰文：全能骑士

神经元及众多其他细胞类型通过分泌信号分子来介导细胞间通讯并维持机体稳态。神经元所采用的一种特殊分泌机制涉及SNARE复合物，该复合物将VAMP2等突触囊泡蛋白与质膜上的SNAP25相连接，从而驱动膜融合过程。鉴于VAMP2和SNAP25在哺乳动物生物学中的核心且保守的作用，细菌毒素已演化出特定机制来干扰这些蛋白质，进而阻断分泌功能并使哺乳动物宿主中毒。

来自破伤风梭菌的破伤风神经毒素（TeNT）通过其轻链编码的金属蛋白酶切割VAMP2。该催化机制赋予TeNT极强的毒性，仅0.2 ng/kg的剂量即可对人类产生致死效应。

图片来源：Annual Review of Biochemistry (2019)

尽管TeNT具有神经毒性，但其高度特异性的作用机制——仅切割哺乳动物蛋白质组中的单一蛋白质——使其成为神经科学领域中一种强有力的研究工具。TeNT中52 kD的蛋白酶结构域可通过遗传学手段靶向特定细胞群体，以沉默突触传递，并已在空间学习和社会行为等功能环路的研究中发挥了重要作用。

此外，TeNT及相关的BoNT（来源于肉毒梭菌的肉毒神经毒素）已被用于跨质膜递送蛋白质货物，且BoNT已被重新改造以切割PTEN等替代性蛋白底物。

图片来源：Science (2008)

为充分挖掘这些毒素作为生物学及神经科学工具的潜力，需要对其蛋白酶活性实现精确的时空控制。若能构建一种单链、光调控的TeNT，在用户选择的时间窗口内于特定脑区被快速激活，则将能够以高精度和最小毒性实现功能性神经环路解析。

此类构建体介导的蛋白水解沉默效应虽持久，但可通过内源性VAMP2分子的补充而实现逆转。

图片来源： Neuron (2019)

2026年7月30日，《Nature Method》杂志在线刊登了斯坦福大学Alice Ting（丁燕萍）课题组的最新重要工作，该研究采用结构导向的蛋白质工程和定向进化策略，成功构建了一种结构紧凑（69 kD）、单链型的光激活破伤风神经毒素（LATeNT）。

LATeNT能够实现对小鼠脑内突触传递的快速且可逆调控，并借此发现了一类调控焦虑样行为的海马中间神经元群体。此外，他们证实LATeNT还可调节抑制性突触中基于内源性大麻素的逆向信号传导，以及胰腺β细胞的胰岛素分泌。最后，通过LATeNT高度序列特异性的特点，他们在缺乏内源性VAMP2表达的HEK293T细胞中构建了可将钙离子、药物或受体活性转化为基因转录和报告蛋白分泌的合成回路。

凭借其简洁的设计和稳健的性能，LATeNT有望在神经科学和合成生物学领域具有广泛的应用前景。

LATeNT的设计与定向进化

本研究采用单链设计方案构建LATeNT（图1a），将光敏LOV结构域插入TeNT表面暴露环区，使其在暗态下通过别构效应扭曲活性中心而失活，蓝光照射则解除钳制恢复酶活性。基于TeNT晶体结构（图1c），在12个环区中选取14个位点插入hLOV结构域，其中位点357/358在光照后VAMP2切割效率提高约1.5倍（图1c、d及补充图1a），该构建体命名为LATeNT0。通过优化hLOV两侧连接肽长度及截短C端Jα螺旋，动态范围显著改善（图1e及补充图1b），获得光/暗活性比为6.7的LATeNT1（图1h）。

为降低LATeNT1的暗态背景活性（图1h），在酿酒酵母中开展了定向进化。将VAMP2锚定于质膜并融合LexA-VP16，使TeNT介导的切割释放转录因子驱动YFP表达，从而将LATeNT活性转化为可经FACS分选的信号（图1f及补充图2c）。通过易错PCR构建LATeNT1突变体文库，经三轮阳性筛选和两轮阴性筛选（图1f及补充图1c），流式细胞术分析显示光照活性与暗态背景均得到改善（图1g及补充图1d）。

第五轮筛选后分析20个富集克隆（补充图2a、b），其中克隆16（C16）含K34R和D397N两个突变，在酵母中暗态活性显著低于LATeNT1而光照活性相当（补充图2c）。该结果在HEK293T-VAMP2报告细胞中得以验证（图1h及补充图2a、b），C16的光/暗活性比达97.3，较LATeNT1的6.7大幅提升，主要归因于暗态活性的显著降低。C16被命名为LATeNT并用于后续实验。

那么，其细胞、神经表达水平如何呢？

笔者注：破伤风神经毒素（TeNT）是破伤风梭菌产生的一种锌离子依赖性金属蛋白酶，能够以高度特异性切割突触囊泡蛋白VAMP2，阻断SNARE复合物组装，从而抑制神经递质释放。由于其仅切割哺乳动物蛋白质组中的单一底物，TeNT已被广泛用作神经科学工具，通过遗传靶向特定神经元群体实现突触传递的功能性沉默，为解析神经环路机制提供了重要手段。

然而，TeNT的组成型活性使其无法在时间维度上实现精确调控，限制了其在需要瞬时干预的实验场景中的应用。

图一 LATeNT的设计与定向进化

LATeNT在HEK293T细胞及原代培养神经元中的表达

为比较LATeNT与野生型TeNT的催化效率，作者将含TeNT或LATeNT的HEK293T细胞裂解液与含VAMP2裂解液共孵育。免疫印迹结果显示，光照条件下LATeNT保留约36%野生型TeNT活性（图2a）。蛋白酶结构域E233A突变和LOV结构域C415A突变使活性完全丧失，而I504E突变则使LATeNT呈现组成型活性（扩展数据图1a）。

可逆性实验结果表明，VAMP2切割随光照时间（30 s~2 h）呈线性增加（图2b及扩展数据图1d），表明LATeNT活性在撤光后数分钟内关闭。而含V381L突变的LATeNT*（LOV关闭速率减慢逾75倍）在撤光后仍持续保持活性超过60 min（图2b及扩展数据图1d）。

在培养神经元中，LATeNT沿突起分布并与突触前标志物Bassoon共定位（图2c及扩展数据图1e）。光照30 min后在LATeNT表达突起上检测到切割型VAMP2信号，该信号与Bassoon共定位（图2c）。免疫印迹显示，光照1 h使内源性VAMP2降低78% ± 3%，约16~24 h后完全恢复（图2d及补充图6d）。

那么，LATeNT在体功能如何呢？

笔者注：Bassoon是一种高度丰富的大型支架蛋白（约420 kD），特异性定位于突触前活性区的细胞基质中，是构成突触前细胞骨架的核心组分。作为活性区标志物，Bassoon通过其锌指结构域和卷曲螺旋结构域与多种突触蛋白相互作用，参与突触囊泡的锚定、聚集及释放位点的组织，在突触前结构的组装和功能维持中发挥重要作用。

在免疫荧光标记实验中，Bassoon被广泛用作识别突触前终末的特异性分子标志，通过与突触囊泡蛋白或其它活性区蛋白的共定位分析，可精确评估突触结构的完整性和功能状态。

图二 LATeNT在HEK293T细胞及原代培养神经元中的表达

LATeNT在脑片及活体水平抑制突触传递

在培养海马神经元中，光照后LATeNT使mEPSC频率和幅度显著降低，与野生型TeNT效应相当（图3a–d）。在小鼠海马CA3-CA1通路中，光照急性脑片后AMPAR和NMDAR介导的eEPSC幅度均显著降低，配对脉冲比升高表明递质释放概率下降（图3e–j）。连续光照下，eEPSC幅度在5 min内可检出降低，20 min达最大抑制（图3k及扩展数据图2d）。单次光照30 min可使诱发eEPSC抑制持续8 h，24 h完全恢复，其抑制持续时间及程度均优于近期报道的双稳态视蛋白PdCO（图3l及扩展数据图2e,f）。LATeNT激活所需光强低至0.03 mW/cm²（扩展数据图2g,h及补充文本2）。

在腹侧海马至内侧前额叶皮质的长程投射中，LATeNT与ChrimsonR共表达，光激活可强效抑制单突触传递（图3m–o及扩展数据图2i–k），免疫染色证实LATeNT成功运输至投射末端（扩展数据图2l）。单侧CA3表达LATeNT后仅光照对侧CA1，可特异性诱导对侧而非同侧CA1的VAMP2切割（图3p–s），表明光激活具有良好的空间特异性。末端VAMP2切割主要通过局部蛋白酶激活实现（扩展数据图3及补充文本3）。

综上，LATeNT可在脑片及活体水平强效抑制突触传递，5 min可检出，20 min达饱和，抑制持续约8 h，24 h可逆，且可通过低功率蓝光实现空间精准调控。

那么，LATeNT如何影响行为学呢？

图三 LATeNT在脑片及活体水平抑制突触传递

LATeNT介导的突触抑制可调控小鼠行为

为验证LATeNT能否操控行为驱动的内源性神经元活动，将AAV双侧注射至小鼠海马CA1区并置于标准环境或丰富环境中饲养（图4a,b及扩展数据图4a）。丰富环境组在每次暴露前经光纤于背侧下托给予30 min蓝光或不照光。丰富环境暴露可显著增强背侧下托c-Fos表达，但该效应在光照组中被完全消除（图4c,d），表明LATeNT介导的CA1至背侧下托突触抑制可阻断环境丰富性驱动的c-Fos表达，切割型VAMP2染色证实了LATeNT的光依赖性激活（扩展数据图4b,c）。而在不接收CA1投射的听觉皮层中，光照则无此效应（扩展数据图4d,e）。

然后，作者通过LATeNT探究CA1 SST⁺中间神经元与焦虑样行为的因果关系。将mCherry–LATeNT或mCherry经Flp依赖型AAV表达于CA1 SST⁺中间神经元（图4e–g）。高架十字迷宫测试中，首次无光照时两组基线相当；第二次光照后仅LATeNT组开臂停留时间显著减少；第三次（1周后）恢复至对照水平（图4h–j）。明暗箱实验中LATeNT激活后明箱停留时间和进入次数均减少（扩展数据图5b–d）；蔗糖偏好实验中LATeNT组无蔗糖偏好（扩展数据图5e）；旷场实验表明LATeNT不影响运动能力（扩展数据图5f–i）。电生理记录证实LATeNT以光依赖方式抑制SST⁺中间神经元至CA1的突触传递（扩展数据图6）。上述结果表明，抑制CA1 SST⁺中间神经元GABA能突触传递可增加焦虑样行为并降低奖赏偏好，而不影响运动能力。

eNpHR介导的SST⁺中间神经元抑制未改变高架十字迷宫开臂停留时间（扩展数据图7），提示焦虑表型需要LATeNT提供的持续性抑制，凸显了本工具的优势。

那么，除了沉默神经元外，LATeNT还调控其他VAMP2依赖的生物学过程吗？

笔者注：eNpHR3.0是第三代增强型氯离子泵，来源于嗜盐古菌（Natronomonas pharaonis），经三次定点突变和膜定位优化改造而成，在黄光（约590 nm）照射下可将氯离子泵入神经元内，从而超极化膜电位并强效抑制动作电位发放。

作为经典的神经抑制型光遗传工具，eNpHR3.0可在毫秒级时间尺度上实现对神经元活动的可逆性操控，因其响应速度快、光敏性高、暗态泄漏电流低而被广泛应用于因果神经环路功能研究。然而，eNpHR3.0介导的抑制依赖于光的持续存在，撤光后效应即迅速消退，无法实现长时间的突触传递持续性阻断，这在一定程度上限制了其在需要较长抑制窗口的行为学实验中的应用。

图四 LATeNT揭示了CA1 SST⁺中间神经元在焦虑样行为中的因果作用

LATeNT调控内源性大麻素信号及胰岛素分泌

VAMP2除介导突触前囊泡融合与神经递质释放外，还参与多种细胞类型的膜融合事件。为探究LATeNT功能，作者在三种不同场景中验证了LATeNT对VAMP2的条件性切割能力。

首先，他们在突触后位点验证LATeNT是否可调控含GluA1的AMPA受体胞吐。在稀疏表达LATeNT的海马神经元中，光照30 min显著减少表面GluA1点状信号，而树突棘密度未发生改变（扩展数据图9），可能与激活时间较短有关。

其次，他们利用LATeNT探究去极化诱导抑制减弱（DSI）的分子机制。将LATeNT特异性表达于突触后锥体神经元，ChRmine表达于突触前CCK BCs（图5a,b）。群体水平实验显示，表达LATeNT的脑片经蓝光照射后DSI显著降低，而不表达LATeNT的脑片则无变化（扩展数据图10a–c）。单细胞记录进一步表明，LATeNT激活可降低DSI，光照20 min即足以产生效应（图5c–f及扩展数据图10d）；对照实验排除了ChRmine意外激活的干扰（图5g–i及扩展数据图10e）。上述结果表明，突触后eCB释放是SNARE依赖性的体内DSI所必需的过程。

再次，他们将LATeNT应用于胰腺MIN6细胞以调控内源性胰岛素分泌。在葡萄糖刺激胰岛素分泌模型中，LATeNT表达细胞经光照30 min后GSIS明显受损（图5j），免疫印迹和共聚焦成像证实了VAMP2的光依赖性切割（图5k及补充图3）。

综上，LATeNT可用于调控神经元及非神经元细胞中多种VAMP2依赖的生物学过程。

笔者注：去极化诱导抑制减弱（DSI）是一种短时程突触可塑性形式：突触后锥体神经元去极化后，内源性大麻素逆向释放至突触前，激活CB1受体，短暂抑制GABA能输入。该过程数秒内发生、持续数十秒，是调控兴奋-抑制平衡的重要负反馈机制。

图五 LATeNT调控内源性大麻素信号及胰岛素分泌

LATeNT的合成生物学应用

蛋白酶因运算速度快而成为合成环路的重要构建模块，此类应用需要序列特异性正交蛋白酶。鉴于LATeNT的高度序列特异性，最后，本研究探索了其在缺乏内源性VAMP2的细胞中构建合成环路的可行性。

作者将LATeNT与CaBLAM融合构建钙离子响应型Ca-LATeNT，在HEK293T细胞中Ca²⁺及FFz存在下VAMP2切割较仅加FFz组提高8.2±1.6倍（图6a）。将LATeNT与arrestin融合，利用GPCR激活后NanoLuc与LATeNT–arrestin之间的BRET实现受体响应型切割，CCL20处理可使VAMP2切割提高5.5±2.8倍（图6b）。

然后，他们构建Gal4–VAMP2–LATeNT融合蛋白与UAS-mCherry共表达，光照后LATeNT切割释放Gal4片段入核驱动基因表达，仅光照组可检测到mCherry信号（图6c）。利用RELEASE系统将VAMP2作为切割序列、SEAP作为分泌货物，光照4 h后培养基中SEAP活性较暗态对照提高4.6倍，活性位点突变E233A则完全消除分泌（图6d）。

再然后将hLOV插入BoNT/A蛋白酶的结构同源位置，所得光激活BoNT/A在光照30 min后对其底物SNAP25切割显著提高（补充图5），表明该设计策略具有普适性。

图六 LATeNT用于缺乏内源性VAMP2细胞中合成通路的构建

本文的局限性

本研究首次开发时空特异性突触沉默技术，但仍存在以下局限性：第一，LATeNT的激活需要较长时间的累积光照。与毫秒级响应的光遗传通道和泵相比，LATeNT在连续光照下需5 min方可检出抑制效应，20 min达饱和，较慢的激活动力学限制了其在需要毫秒级时间精度实验中的应用；第二，LATeNT的作用机制依赖于VAMP2的切割与内源性蛋白的重新合成，虽可通过新合成蛋白实现逆转，但抑制窗口长达8 h、完全恢复需约24 h，难以实现快速可逆的瞬时操控；第三，LATeNT的底物特异性限制了其应用范围。该工具仅切割VAMP2，难以直接推广至其他蛋白靶点或用于需要切割多种底物的合成生物学场景。虽已初步验证可在BoNT/A中采用类似设计策略，但将其通用化至任意目标蛋白仍需进一步改造。

总结

破伤风神经毒素轻链是一种金属蛋白酶，能够通过切割内源性囊泡融合蛋白VAMP2而强效抑制突触传递，然而其固有的组成型活性阻碍了时空精度的实现。

为解决这一问题，本研究通过将光敏LOV结构域插入别构位点，并经由定向进化优化其动态范围，从而构建了光激活破伤风神经毒素（LATeNT）。在黑暗条件下，LATeNT的活性检测不到，但在弱蓝光照射10至20分钟后，该蛋白酶被激活，从而在体内强效抑制突触功能。本研究表明，LATeNT可在多个脑区以及长程轴突投射中发挥作用，且其效应在24小时内可逆。

借助LATeNT，作者发现了一类调控焦虑样行为的海马中间神经元群体，并证明了突触后内源性大麻素胞吐作用在体内去极化诱导的抑制减弱（DSI）过程中的重要性。除神经科学领域之外，LATeNT还可调控胰腺β细胞的内源性胰岛素分泌，并在HEK293T细胞中将药物暴露、钙离子升高或受体激活转化为转基因表达或报告蛋白分泌。LATeNT具有较大的动态范围、高度光敏感性及持续效应，为在多种生物系统中实现具有时空分辨率的通用型蛋白水解调控提供了有力工具。

参考文献

Roh H, Kim D, Kim B, Jeon Y, Malhotra S, Kim H, Kim Y, Jacko M, Klein PM, Lin C, Xu F, Soltesz I, Um JW, Ting AY. Light-activated tetanus neurotoxin for conditional proteolysis and inducible synaptic inhibition in vivo. Nat Methods. 2026 Aug;23(8):1598-1610. doi: 10.1038/s41592-026-03176-w. Epub 2026 Jul 30. PMID: 42533122; PMCID: PMC13442000.

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