上海
CRISPR-Cas12a 系统因其特有的反式切割活性，在无扩增分子诊断领域展现出巨大潜力。近年来，利用分裂激活剂调控 Cas12a 活性的策略备受关注，但现有研究缺乏对激活剂双链全位点切口组合效应的系统性认知，切口位置与 Cas12a 催化动力学之间的定量关系仍未得到全面解析。这导致现有基于分裂激活剂的检测设计大多仅依赖于少数孤立位点的散在设置，限制了检测灵敏度的进一步突破。如何精准、可预测地设计分裂激活剂以大幅提升检测性能，仍是该领域面临的核心瓶颈。
近日，广州中医药大学翟筠秋副研究员 与中山大学栾天罡教授 合作在Advanced Science杂志上发表了题为Systematic Position Mapping of Split CRISPR-Cas12a Activators Enables Highly Sensitive miRNA Detectionand Cancer Cell Stratification的研究论文。通过系统性地在双链DNA激活剂的两条链上所有位置引入切口，绘制了完整的活性调控图谱，并基于此开发的高性能分裂激活剂，实现了无扩增、aM（阿摩尔每升）级别的miRNA检测，并成功应用于活细胞中多种miRNA的成像与癌细胞分层。该设计原则可进一步地拓展至非核酸靶标分析，利用调控图谱精确设计开关机制大幅提升了非核酸靶标的检测灵敏度，实现了对APE1酶（ 0.0073 U/L ）及小分子次氯酸（ 2.37 pM ）的超灵敏检测，展示了该平台的广阔应用价值。
在该研究中，为了建立设计分裂 DNA 激活剂的设计原则，研究人员在双链 DNA 激活剂的目标链（ TS ）和非目标链（ NTS ）的每一个位置分别引入切口，构建了超过 200 种不同的组合，系统评估了它们对 Cas12a 反式切割活性的影响。研究发现， TS 上的切口普遍抑制 Cas12a 的活性，而 NTS 上存在切口则能够增强 Cas12a 的激活效率。当目标链切口与非目标链切口组合时，情况则变得复杂。非目标链的切口可以缓解甚至逆转目标链切口带来的抑制效应，两者展现出强烈的协同调控作用。其中，组合 3'STS11/5'SNTS5 使反式切割活性提升了近 9 倍。
图 1 双链 DNA 激活剂上的切口位置组合对 Cas12a 反式切割活性的差异性调控
进一步进行机制探究发现，顺式切割的动力学参数与最终的反式切割活性呈显著正相关。这表明，顺式切割步骤是整个反式切割反应的一个关键动力学瓶颈。切口可能通过改变 DNA 双链的局部柔性与构象，影响 Cas12a 的催化口袋对底物的可及性，从而决定顺式切割的效率，并最终控制反式切割信号的输出。
图 2 顺式切割动力学参数与 Cas12a 反式切割活性的正相关性分析
基于上述设计规则，研究人员将最优的分裂激活剂应用于 miRNA 检测。在核酸检测中，该策略实现了对 miR-141 的超灵敏分析（ LOD 低至 112 aM ），灵敏度较完整激活剂提升了约 480 倍，并在多种 miRNA 检测中展现出良好的通用性。在活细胞应用层面，该系统不仅完成了内源性 miRNA 的高特异性原位成像，还实现了对不同恶性程度肝细胞系中多重 miRNA 表达谱的并行分析；结合机器学习算法，实现了不同恶性程度肝细胞系的准确分类与分层。
此外，基于对激活剂结构的深度理解，研究人员巧妙引入了 “ 切口可编程性 ” 的设计理念。通过将靶标响应性切割位点设计在激活剂的功能关键位置，将这一系统优势顺畅延伸至非核酸领域，成功实现了对癌症相关修复酶 APE1 （ LOD: 0.0073 U/L ）以及环境与生理指标小分子次氯酸（ LOD: 2.37 pM ）的超灵敏检测，充分证明了该调控法则在多元化生物传感中的通用性与广阔前景。
图 3 “ 切口可编程性 ” 策略将 Cas12a 传感平台拓展至非核酸靶标的超灵敏检测
综上所述，该项工作通过系统性的位置图谱绘制，将分裂激活剂从经验性观察提升至理性设计层面。所建立的设计规则和优化的分裂激活剂，为开发高灵敏度、可编程的 CRISPR-Cas12a 通用型生物传感平台奠定了坚实基础，在分子诊断、环境监测等领域具有广阔的应用前景。
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.76576
制版人：十一
学术合作组织
（*排名不分先后）
推荐直播
转载须知
【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。
BioArt
Med
Plants
人才招聘
特别声明：以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布，本平台仅提供信息存储服务。
Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services.
