美白新选择！河豚源酪氨酸酶抑制肽高效低毒抑制黑色素生成，为天然抗色素沉着剂开发提供新策略

黑色素的过度生成与沉积会导致黄褐斑、雀斑、晒斑、老年斑、炎症后色素沉着等多种皮肤问题，不仅影响美观，还可能威胁皮肤健康。酪氨酸酶是黑色素生物合成通路中的限速酶，因此抑制酪氨酸酶活性成为开发美白、抗色素沉着产品的核心策略。目前广泛使用的熊果苷、氢醌、曲酸等传统酪氨酸酶抑制剂，普遍存在细胞毒性较高、稳定性较差、皮肤刺激甚至潜在致突变性等问题，开发高效、低毒、天然的替代抑制剂迫在眉睫。

近日，中国农业大学营养与健康研究院朱银华副教授团队联合北京河豚家族科技产业有限公司段然博士在Food Science and Human Wellness期刊（一区top，影响因子7.3）上发表题为“Separation, identification, and anti-melanogenic efficacy validation of tyrosinase inhibitory peptides from pufferfish (Takifugu obscurus) hydrolysates”的研究论文。该研究以我国合法养殖的暗纹东方豚加工后副产物—鱼皮及碎肉为原料，通过“酶解筛选—肽段鉴定—虚拟对接—合成验证—细胞与斑马鱼功效评价—转录组机制解析”的完整研究链条，系统挖掘出具有抗黑色素生成活性的河豚源生物活性肽。其中，活性肽Pep2（LRVAPEEHPTL）的体外酪氨酸酶抑制活性显著超越阳性对照熊果苷，且在细胞和斑马鱼体内展现出远超熊果苷的生物安全性。该研究不仅为天然美白剂的开发提供了极具潜力的候选分子，也为河豚蛋白资源的高值化利用开辟了新路径！

研究背景

黑色素是保护皮肤细胞免受紫外线损伤的重要色素，但其异常过量生成与沉积会导致黄褐斑、日光性黑子、雀斑、老年斑、炎症后色素沉着，甚至恶性黑色素瘤等问题。研究还表明，多种黑色素生成相关疾病与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病存在关联。酪氨酸酶是一种含铜氧化酶，是黑色素合成通路中的限速酶，负责催化L-酪氨酸羟基化为L-DOPA、并进一步氧化为多巴醌，最终生成黑色素。因此，靶向抑制酪氨酸酶活性一直是美白与抗色素沉着产品研发的核心策略。

然而，传统合成酪氨酸酶抑制剂存在明显短板：熊果苷、氢醌在高浓度下细胞毒性显著，曲酸存在稳定性差与安全性争议，这些问题严重限制了其在化妆品和医药领域的应用。近年来，食源性生物活性肽因具有低毒性、高生物相容性、易吸收、活性多样等优势，成为天然酪氨酸酶抑制剂的重要来源。目前，研究者已从米糠清蛋白、核桃粕、鳄鱼血清、鱼鳞、珍珠层粉等多种蛋白资源中成功分离出酪氨酸酶抑制肽，证实了从可食用资源中筛选天然抗黑色素肽的可行性。

暗纹东方豚（Takifugu obscurus）是我国重要的养殖经济鱼类，也是国家批准可有条件养殖、加工和经营的两种河豚品种之一。经标准化养殖与规范加工后的暗纹东方豚肌肉安全无毒，富含优质蛋白，是一座尚未充分开发的“功能肽宝库”。以往针对暗纹东方豚的研究主要集中于鲜味肽和血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，而其蛋白水解物作为抗黑色素生成肽来源的潜力几乎无人涉足。针对这一空白，本研究系统开展了河豚源酪氨酸酶抑制肽的分离、鉴定与功效验证工作。

核心发现

1. 五种蛋白酶筛选：胃蛋白酶水解物酪氨酸酶抑制活性最强，媲美熊果苷

研究团队分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对暗纹东方豚肌肉蛋白进行酶解，经超滤（截留分子质量1000 Da）与透析（300 Da）获得分子质量300～1000 Da的小分子肽混合物。以熊果苷为阳性对照（10 mg/mL时抑制率96.76%）评价五种酶解肽的体外酪氨酸酶抑制活性，结果显示：胃蛋白酶水解物活性最强，10 mg/mL时抑制率达87.01%，显著高于胰蛋白酶（33.75%）、碱性蛋白酶（31.79%）、木瓜蛋白酶（31.03%）和风味蛋白酶（19.75%）水解物。

胃蛋白酶偏好切割疏水性氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸）邻近的肽键，而这些疏水残基恰恰是与酪氨酸酶疏水活性口袋形成稳定相互作用的关键，这可能是其水解物高活性的重要原因。

图1：五种蛋白酶酶解制备河豚肽的流程示意及其体外酪氨酸酶抑制活性筛选。胃蛋白酶水解物活性显著优于其余四种蛋白酶。

2. 细胞与斑马鱼双重验证：河豚肽高效抑黑，且安全性远胜熊果苷

在α-MSH诱导的B16-F10小鼠黑色素瘤细胞模型中，胃蛋白酶水解肽在0.25～4.0 mg/mL范围内对细胞活力无显著影响（4.0 mg/mL时细胞活力仍高于90%），而同浓度熊果苷表现出明显的剂量依赖性细胞毒性，4.0 mg/mL时细胞活力降至56.43%。与此同时，河豚肽可显著降低细胞内黑色素含量与酪氨酸酶活性，细胞颜色肉眼可见地变浅。

在斑马鱼体内模型中，河豚肽（50、100 μg/mL）可剂量依赖性地减少斑马鱼体表黑色素沉积，体内黑色素含量显著下降。尤为关键的是安全性对比：熊果苷（100 μg/mL）处理使斑马鱼存活率降至约70%，而所有河豚肽处理组存活率接近100%。这表明河豚肽在保持优异体内抗黑色素功效的同时，克服了熊果苷严重的系统性毒性缺陷，实现了功效与安全的良好平衡。

图2：胃蛋白酶水解肽在α-MSH诱导的B16-F10细胞及斑马鱼体内模型中的抗黑色素生成效果与安全性评价。

3. LC-MS/MS鉴定联合分子对接：虚拟筛选出5 条高亲和力候选肽

通过nano-LC-MS/MS对胃蛋白酶水解肽混合物进行肽序列鉴定，再以蘑菇酪氨酸酶晶体结构（PDB: 2Y9X）为靶标进行分子对接虚拟筛选，最终获得5 条结合亲和力优异的候选肽（Pep1～Pep5）。其中Pep2（LRVAPEEHPTL，结合能−7.3 kcal/mol）与Pep5（TYVTPHQTF，−7.2 kcal/mol）表现最佳。五条肽均能深入、稳定地对接进酪氨酸酶的疏水活性空腔，与ASN70、GLY68、ASP49、LEU9、GLN48、MET67等多个氨基酸残基形成氢键和静电相互作用。尽管蘑菇酪氨酸酶与人源酪氨酸酶整体同源性较低，但二者由六个保守组氨酸残基配位的双核铜催化中心在结构上高度保守，因此该对接模型对预测肽与人源酪氨酸酶的相互作用具有重要参考价值。

图3：LC-MS/MS肽段鉴定流程及5 条候选肽与酪氨酸酶（PDB: 2Y9X）的分子对接结果。

4. 合成肽体外验证：Pep2抑制活性显著超越熊果苷

对5 条候选肽进行化学合成（纯度≥98%）并开展体外酪氨酸酶抑制实验。结果显示：Pep2（LRVAPEEHPTL）在2.5 mg/mL时抑制率达87.31%，5.0 mg/mL时进一步升至90.97%，而同浓度熊果苷的抑制率仅为31.26%和50.45%——Pep2的活性约为熊果苷的1.8～2.8倍！经非线性回归分析，Pep2的IC50为1.573 mg/mL，优于已报道的珠母贝（Pinctada martensii）和草鱼鱼鳞明胶来源肽（IC50为2.55～3.87 mg/mL）；在5.0 mg/mL时，其90.97%的抑制率也远超大眼金枪鱼皮（59.90%～63.10%）和罗非鱼皮（59.73%）来源肽。Pep5活性次之，其余三条肽活性相对较弱。Pep2富含疏水性氨基酸（亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸），有利于深入嵌入酪氨酸酶的疏水活性中心，这是其卓越活性的结构基础。

图4：5 条合成肽与熊果苷在不同浓度下的体外酪氨酸酶抑制活性对比。

5. 细胞水平确认：Pep2安全高效抑制黑色素生成

在α-MSH诱导的B16-F10细胞模型中，Pep2与Pep5在0.125～1.0 mg/mL浓度范围内细胞活力始终保持在95%以上，无可见细胞毒性；二者均可显著降低细胞内黑色素含量与酪氨酸酶活性，其中Pep2的起效浓度（0.125 mg/mL）低于Pep5（0.25 mg/mL），显示出更优的生物利用度。综合体外酶活与细胞实验结果，Pep2被确定为最具开发潜力的核心活性肽。

图5：合成肽Pep2、Pep5在α-MSH诱导的B16-F10细胞中的安全性与抗黑色素生成效果。

6. 机制解析一：Pep2下调MC1R–Mitf–Tyr经典黑色素生成信号轴

RT-qPCR结果显示，α-MSH可显著上调黑色素生成关键基因Mc1r、Mitf、Tyr、Tyrp1、Dct的表达，而Pep2和Pep5均能不同程度地抑制这些基因的过度表达，抑制强度为熊果苷＞Pep2＞Pep5。值得注意的是，Pep2还下调了ERK–MAPK通路关键基因Mapk1的表达。综合分析表明，Pep2的抗黑色素作用主要通过下调MC1R–Mitf–Tyr轴（转录水平）实现，ERK–MAPK通路（转录后水平）则作为协同调控分支精细调节MITF稳定性，体现了肽类抑制剂多层次、网络化的调控特征。

图6：Pep2、Pep5对B16-F10细胞中黑色素生成相关基因（Mitf、Tyr、Tyrp1、Dct、Mc1r、Mapk1）mRNA表达的影响。

7. 机制解析二：转录组学揭示cAMP-PDE轴等潜在新靶点

RNA-seq转录组分析进一步揭示，Pep2可整体逆转α-MSH诱导的转录组异常。与熊果苷相比，Pep2展现出独特的多靶点调控图谱：特异性富集3’,5’-环核苷酸磷酸二酯酶（PDE）活性、线粒体动力学及金属离子跨膜转运相关通路。关键基因层面，Pep2显著上调Pde2a——PDE是降解细胞内cAMP的主要酶，而cAMP正是α-MSH/MC1R信号的关键第二信使，这提示Pep2可能通过加速cAMP清除，在受体后水平“拦截”黑色素生成信号级联；同时，抗氧化酶基因Sod3的补偿性过表达被恢复正常，金属离子转运体Slc11a1的表达调控则提示Pep2可能干扰酪氨酸酶成熟与催化所必需的铜离子供应。这些发现提示Pep2“直接抑酶+信号阻断+氧化还原稳态修复”的多靶点协同机制。

图7：转录组学分析揭示Pep2的全局调控网络与潜在新靶点（Pde2a、Sod3、Slc11a1）。

研究亮点：天然来源+高效低毒+多靶点机制

与传统酪氨酸酶抑制剂相比，河豚源活性肽具有三大核心优势：

1.天然来源，安全可食：

原料为合法养殖的暗纹东方豚加工副产物，与生物系统相容性好，细胞实验（活力＞90%）与斑马鱼实验（存活率近100%）共同证实其安全性显著优于熊果苷；

2.活性卓越，超越标杆：

核心肽Pep2的体外酪氨酸酶抑制活性约为同浓度熊果苷的1.8～2.8 倍，IC50优于多种已报道水生来源活性肽；

3.机制清晰，多靶点协同：

除直接结合抑制酪氨酸酶外，还通过下调MC1R–Mitf–Tyr经典信号轴、调控MAPK通路、并可能经cAMP-PDE轴加速第二信使清除，形成多层次的抗黑色素调控网络。

总结与展望

本研究首次系统挖掘了暗纹东方豚加工副产物中的抗黑色素生成肽资源，建立了“酶解制备—超滤/透析分离—LC-MS/MS鉴定—分子对接虚拟筛选—合成验证—细胞与斑马鱼功效评价—转录组机制解析”的完整技术路线，筛选获得高活性、高安全性的酪氨酸酶抑制肽Pep2（LRVAPEEHPTL）。该研究实现了河豚蛋白资源的高值化利用，为食品、化妆品和医药领域天然、安全抗色素沉着产品的开发提供了理论依据与候选分子。

未来，研究团队将进一步通过Western blot验证MAPK通路关键蛋白的磷酸化水平，通过胞内cAMP定量等功能实验确证cAMP-PDE调控轴；并围绕Pep2的胃肠道稳定性（功能食品方向）、透皮吸收性能（化妆品方向）开展系统评价，结合响应面法优化酶解工艺参数、开展结构修饰与复配协同研究，推动河豚源美白肽走向产业化应用。

图8：河豚源生物活性肽抗黑色素生成作用机制示意图。Pep2通过直接结合抑制酪氨酸酶、整体下调MC1R–cAMP–MITF经典信号级联、并可能经PDE2A加速cAMP降解等多靶点网络抑制黑色素生成。

作者简介

朱银华，男，中国农业大学营养与健康系副教授，博士生导师，优秀人才引进学者。长期致力于运用化学生物学与营养学交叉策略，聚焦天然产物功能解析与精准营养干预研究，主要研究方向包括：膳食活性成分的靶点鉴定与机制解析、新型抗衰老功能因子的发掘与应用以及功能性食品设计与开发。近年以第一作者及通讯作者（含共同）在 Cell Research、Exploration、Cell Chemical Biology、Environmental International、Aging Cell、Phytomedicine 等国际高水平期刊发表30余篇研究论文，其中相关成果获 2020年度赛诺菲-Cell Research优秀论文奖。主持“十四五”国家重点研发计划课题、省部级及横向项目10 项，其技术转化成果“生物强化DHA乳产业化关键技术开发与应用”荣获2024年中国乳制品工业协会技术进步奖特等奖（排名第一）。

段然，内蒙古呼伦贝尔人。农学博士，副教授。本科毕业于兰州大学。北京河豚家族科技产业有限公司董事长，长期从事河豚鱼全产业链工作，包含从河豚鱼育苗、养殖，加工、餐饮以及供应链业务。担任国家十四五重点研发计划课题主持人。为北京市东城区政协委员，北京市东城区青联副主席，北京市东城区高级人才，广东省中山市农业领域特聘人才。中国渔业协会河豚产业分会执行会长，中国水产流通与加工协会河豚美食文化分会会长。

Separation, identification, and anti-melanogenic efficacy validation of tyrosinase inhibitory peptides from pufferfish (Takifugu obscurus) hydrolysates

Wenhua Jin a,#, Zhixi Gengb, #, Yan Zhang c, #, Chang Fan a, Yang Yang a, Yanjin Du a,Hejing Tanga, Ran Duan d, *, Yinhua Zhu a, *

a Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Department of Nutrition and Health, China Agricultural University, Beijing, China, 100193

b Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agricultural Environment, MARA, Beijing, China, 100081.

c Information Technology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing, China, 100097

d Beijing Pufferfish Family Technology Industry Co., Ltd, Beijing, China, 100102.

#These authors contributed equally to this paper

*Corresponding author

E-mail addresses: duanran8328@sohu.com (R. Duan);zhuyinhua@cau.edu.cn (Y. Zhu)

ABSTRACT

Abnormal melanin overproduction leads to hyperpigmentation disorders, and tyrosinase is the rate-limiting enzyme in melanin biosynthesis. To develop natural and safe tyrosinase inhibitors, this study systematically explored anti-melanogenic peptides from the muscle proteins of Takifugu obscurus. Five commercial proteases (pepsin, trypsin, flavourzyme, papain, and alkaline protease) were used for enzymatic hydrolysis, and pepsin was identified as the optimal enzyme. The pepsin-hydrolyzed peptide fraction (300–1000 Da) exhibited a tyrosinase inhibition rate of 87.01% ± 2.64% at 10 mg/mL, comparable to arbutin (96.76% ± 1.12%) but with significantly lower cytotoxicity (cell viability > 90% at 4.0 mg/mL vs 56.43% ± 1.20% for arbutin). Peptide identification via nano-LC-MS/MS and virtual screening using molecular docking with mushroom tyrosinase led to the selection of five candidate peptides (Pep1–Pep5). Notably, Pep2 (LRVAPEEHPTL) showed the highest binding affinity and significantly outperformed arbutin in in vitrotyrosinase inhibition at certain concentrations. In α-MSH-stimulated B16-F10 melanoma cells, both crude pepsin hydrolysates and synthetic Pep2 effectively reduced melanin content and cellular tyrosinase activity without obvious cytotoxicity. Furthermore, an in vivo zebrafish model confirmed that the pepsin-hydrolyzed peptides effectively inhibited melanin accumulation while maintaining excellent biosafety (near 100% survival), overcoming the severe toxicity limitations of arbutin. Mechanistic investigation using real-time quantitative reverse transcription PCR and global RNA-seq transcriptomic analysis revealed that Pep2 downregulated key genes involved in melanogenesis, including Mitf, Tyr, Tyrp1, Dct, Mc1r, and Mapk1. These findings demonstrate that T. obscurus peptides, particularly LRVAPEEHPTL, are promising natural tyrosinase inhibitors witha multi-level regulatory network. Alongside direct enzyme binding and classical transcriptional suppression, transcriptomic profiling suggests their potential to modulate the cAMP-PDE axis, further blunting the upstream melanogenic signal. These synergistic properties offer great potential for applications in functional foods and cosmetic formulations.

Keywords:

Takifugu obscurus; Tyrosinase inhibitory; Anti-melanogenesis; Molecular docking; Bioactive peptides

参考文献：

Jin W, Geng Z, Zhang Y, et al.Separation, identification, and anti-melanogenic efficacy validation of tyrosinase inhibitory peptides from pufferfish (Takifugu obscurus) hydrolysates. Food Science and Human Wellness, 2026, https://doi.org/10.26599/FSHW.2026.9251228

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