抗生素出海：单核细胞活化试验（MAT）法替代 家兔热原法（RPT）优势分析

在全球医药监管日益严格的背景下，欧洲药典（EP）对抗生素的热原检测要求不断更新。许多品种的方法已从传统的家兔热原检测法（RPT，Rabbit Pyrogen Test）转变为细菌内毒素检测法（BET，Bacterial Endotoxin Test）。然而，仅使用BET法可能不足以完全控制热原风险，非内毒素热原（NEP）的“隐形威胁”是当前合规申报的核心挑战，这也是单核细胞活化试验（MAT）法被推上风口的关键原因之一。

法规倒计时：RPT 正式退场，MAT 登上舞台

• 2025.07.01起，EP 11.8补编版正式删除家兔热原法（RPT），MAT成为唯一被推荐的替代方法[1]；
• 2025年8月，EP 12.0版本发布，进一步强化指导原则：

○ EP 5.1.13（致热原性）明确规定：若选择BET作为唯一检测方法，必须提供排除产品中存在NEP的详细风险评估报告。

○ EP 2.6.30正式将单核细胞活化试验（MAT）列为能够检测所有类型热原（包括内毒素与各类NEP）的法定方法。

• 2026年起，欧洲药品质量管理局（EDQM）在现场核查中，已将“是否建立并执行了有效的NEP控制策略”列为高频检查项目。

这意味着，对于抗生素出海企业而言，NEP已从一个技术概念，升级为一项紧迫的合规必答题。

抗生素中热原控制发展历史概述

EP第三版（1997年版）抗生素热原检测主要以RPT为主，自1986年《欧洲动物保护公约》通过以来，欧洲药典委员会加速开展体外替代方法的应用，以便响应3R原则（减少、优化、替代动物试验）的推进。

抗生素热原检测RPT转变为BET列表[2]

随着时间推移，EP7.0版49种发酵或半合成半发酵抗生素专论中热原检测RPT被BET取代。然而，这场替代浪潮并未覆盖所有抗生素，EP11.0版仍有部分抗生素保留了RPT[3]，其主要原因在于，已有数据不足证明RPT可以被BET替代。

抗生素热原检测RPT未转变为BET列表

EP已正式废除RPT，并明确将MAT作为首选替代方法。那么未完成RPT替换的品种该如何锚定适配的热原检测方法？已完成BET替代的49种抗生素，是否就真正实现了热原防控的“高枕无忧”？

EP5.1.13致热原性一般性章节中给出答案：

• 只有在排除非内毒素热原性物质存在的情况下，BET法才适用；
• 如果选择BET作为检测特定产品致热原性的唯一方法，则必须对潜在的NEP进行风险评估；
• 若无法排除NEP的存在，则应使用MAT；
• 对于已获批工艺，建议评估其潜在的NEP风险。一旦生产工艺发生变更，也须开展NEP风险评估，并将报告随变更申请一并提交。

抗生素申报合规风险——NEP恰好是“高发区”

抗生素生产的复杂工艺本身，就是NEP的潜在引入点。从上游发酵的原材料与代谢产物，到下游纯化与设备清洁的每个关键步骤，均需进行前瞻性的风险评估。只有对全过程进行系统审视，才能构建起针对NEP的全面防控体系。

抗生素发酵和回收工艺[4]

风险评估内容—存在非内毒素热原（NEP）的可能性有多大？

• 生产工艺用菌株的特性：使用菌为G+或G-，评估是否可能含有脂磷壁酸（LTA）或肽聚糖等热原成分；评估特定蛋白表达水平（例外毒素、其他蛋白质）
• 发酵工艺残留革兰阳性菌（HKSA、LTA）、肽聚糖、酵母多糖等，都属于NEP。这些杂质与LPS协同刺激，可放大细胞因子含量，临床引发放大热原反应
• 评估培养基成分及来源：动物源性（是否存在病毒）、植物源性（是否存在霉菌毒素或是否为合成途径）
• 原材料的生物负载
• 生产工艺中潜在的交叉污染以及环境监测
• 下游工艺去除热原的能力

○ 用有机溶剂进行提取过程，该溶剂能溶解目标化合物但不会溶解水溶性热原物质

○ 过滤工艺用于分离如蛋白质或DNA/RNA等分子量较高的物质

○ 通过使用强酸或强碱来改变pH值，这可能会破坏某些热原物质（即目标化合物是稳定的）

风险评估方法[1]：

EP致热原性5.1.13指出对于那些无法排除存在NEP的药品，建议在进行BET的验证实验时，同时使用相同的3批次进行MAT交叉验证实验。如果重要工艺参数发生变化，应再次在3批次上进行交叉验证。

EP11.8补编 2.6.30-6.5章节中关于NEP方法验证要求：

• 预实验应包括使用至少2种NEP配体（如肽聚糖、脂磷壁酸、合成细菌脂蛋白、鞭毛蛋白等）对检测系统进行验证，其中至少1种需加标至待检制剂中。
• 如有历史批次中已证实受NEP污染物污染的阳性样品，可优先使用；如无则可选择生产工艺可能引入的NEP对检测系统进行验证。

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