浙江
在基于核酸扩增技术（NAT）的支原体检测中，检测限（LOD）常被视作方法灵敏度的核心指标。然而，在实际的方法学验证与应用中，一个常被忽视的问题是：
LOD的可靠性首先取决于支原体菌株的质量。
支原体检测qPCR扩增
一、NAT检测的本质：检测支原体核酸
与培养法不同，NAT方法直接检测支原体DNA信号，这意味着：
1、NAT无法区分活菌与死菌
2、检测结果高度依赖样品中的基因拷贝数（GC）
dPCR检测支原体GC
对于支原体菌株，行业通用的生物学定量单位是菌落形成单位（CFU），关键在于，GC与CFU之间并不存在恒定比例关系。
二、GC/CFU比值：影响LOD的关键但隐蔽因素
1、在支原体菌株制备过程中，常面临以下挑战：
支原体液体培养
- 支原体易聚集，难以均匀分散。
- 不同种类支原体培养条件差异大，工艺复杂。
- 支原体个体微小，不易直接观察计数。
- 培养过程中容易产生死菌。
- 死菌会释放游离DNA，显著抬高GC含量。
2、当GC/CFU比值过高时：
- LOD在数据上看似更低。
- 实际检测信号可能主要来源于死菌核酸。
- 对于核酸检测而言，高浓度的检测对于检测体系要求反而更低。
- 导致核酸法灵敏度被“虚假放大”。
三、行业共识：并非所有菌株都适合用于LOD验证
1、当前行业普遍认同
- ATCC提供的标准支原体菌株在一致性和可追溯性方面更具优势。
- 多数合格菌株的GC/CFU比通常控制在10以下（除非另有说明）。
- 应选择适用于NAT方法LOD验证和方法学确认的菌株。
2、EP 2.6.7草案（Pharmeuropa 36.1）对于菌株的要求：
- 支原体应在生长的指数阶段收获，以保证菌株活性。
- 应在冻存工作悬浮液/稀释液之前测定CFU。
- CFU的测定应进行一定数量的重复。
- 对于基因组拷贝数(GC)的测定，必须同时考虑上清和细胞这两种组分。
- 确定GC/CFU比值的接受标准：除非另有说明，否则参考品的GC/CFU比值应小于10。
3、USP 77征求意见稿菌株要求：
支原体培养物应进行计数，并对基因组拷贝（即其GC/CFU比值）进行表征。
4、JP G3-14-170菌株要求：
应预先建立菌株库CFU和核酸拷贝数之间的关系（即GC/CFU比值）。
四、为什么菌株质量，对QC与法规合规至关重要？
1、在核酸法支原体检测中，我们不仅应当关注方法是否“足够灵敏”，更要关注：
- 灵敏度是否真实反映污染风险？
- LOD是否建立在生物学真实的验证基础之上？
2、菌株质量是连接方法性能与放行风险的关键桥梁。此外，标定菌株所用的测试方法是否经过验证，也严重影响了菌株的质量。
- 培养体系是否经过验证，以确保培养基的检测灵敏度。
- GC测定方法是否经过验证，以保证结果的可靠性（不同的GC测定方法可能导致结果差异）。
核心结论：
支原体核酸检测，只有基于高质量菌株基础上的低LOD，才具有真正的质量意义。
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