一作解读 | NC | 宁波大学陈剑平院士/羊健教授团队揭示小麦病毒“糖衣炮弹”式致病新策略

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（来源：小麦研究联盟）

小麦（Triticum aestivum L.）是我国重要的粮食作物之一，其高产稳产是保障国家粮食安全的关键。小麦黄花叶病是我国主要的小麦土传病毒病，该病害的主要病原为小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus, WYMV）。近年来，WYMV在我国冬小麦种植区呈现“北移西扩”现象，严重威胁我国小麦的安全生产。 N-糖基化是真核生物中重要且广泛存在的蛋白翻译后修饰，参与细胞分化、发育、信号转导和免疫应答等重要过程，影响蛋白质的折叠、降解和分泌等特性。已有研究表明N-糖基化修饰参与了病原真菌的致病过程。然而，植物病毒蛋白的N-糖基化修饰及其在病毒侵染中的作用仍鲜有报道。 近日，宁波大学陈剑平院士、羊健教授团队在《Nature Communications》上发表了“The oligosaccharyltransferase TaOSTIB promotes viral infection by enhancement of RNA silencing suppression in wheat”的研究论文，揭示了小麦寡糖转移酶TaOST1B调控P1蛋白N-糖基化修饰促进病毒侵染的致病机制。研究结果如下：

1.TaOST1BHap1正调控WYMV的侵染

研究团队通过对我国480份黄淮海麦区小麦品种进行全基因组关联和精细定位分析，发现一个编码小麦寡糖转移酶亚基的基因TaOST1B与WYMV的抗性相关。单倍型分析发现该基因主要存在4单倍型与WYMV抗性关联，与Hap1/Hap3相比，Hap2/Hap4的共有变异缺失了6 bp（18和19位2个氨基酸），且Hap2/Hap4对WYMV的易感性明显低于Hap1/Hap3（图1）。进一步遗传学分析结果显示，TaOST1BHap1转基因株系促进WYMV的侵染，敲除株系抑制病毒积累并减轻花叶症状（图2），而TaOST1BHap4转基因株系则不影响WYMV的侵染。这表明TaOST1BHap1正调控了WYMV的侵染。

图1 在小麦2B染色体上鉴定到TaOST1B为WYMV抗性相关基因

图2 TaOST1BHap1正调控WYMV对小麦的侵染

2. TaOST1BHap1与WYMV P1互作调控P1 116位天冬酰胺的N-糖基化

进一步研究发现，TaOST1BHap1与WYMV编码的P1互作且共定位在内质网。糖苷酶酶切、N-糖基化抑制剂衣霉素处理验证以及LC-MS/MS检测确定P1的116位天冬酰胺发生N-糖基化修饰，LC-MS/MS定量分析发现P1的N-糖基化丰度在TaOST1BHap1转基因株系中显著增加，而在敲除株系中显著降低（图3）。

图3 TaOST1BHap1与WYMV P1互作调控P1 116位点的N-糖基化

3. P1 N-糖基化有助于其进入细胞核维持VSR活性，促进WYMV感染

通过单点突变将P1 116位天冬酰胺突变为非糖基化的丙氨酸获得突变型侵染性克隆WYMV（P1N116A），野生型与突变型侵染性克隆致病力分析发现，WYMV（P1N116A）对寄主的致病力明显减弱。随后，对P1与P1N116A的亚细胞定位分析发现，P1N116A在细胞核中的定位明显减弱甚至消失，并且在细胞质中出现明显的点状聚集。进一步对P1N116A C端融合一个核输入信号（P1N116A-NLS）增强其细胞核定位，并在接种WYMV（P1N116A）的植株中瞬时过表达P1N116A-NLS，结果发现突变型侵染性克隆致病力明显恢复。此外，沉默抑制子活性分析发现，P1N116A的沉默抑制子活性几乎丧失，而P1N116A-NLS的沉默抑制子活性可恢复到与P1相当。进一步研究发现，P1和P1N116A-NLS可与CaMTA3互作阻断CaM3与CaMTA3的结合，并显著抑制RNAi通路中RDR6的表达，P1N116A则不能（图4）。

图4 P1的N-糖基化有助于其进入细胞核维持VSR活性

4. N-糖基化的P1与TaIMP-α2互作进入细胞核

研究通过LC-MS/MS鉴定到一个核转运蛋白TaIMP-α2，N-糖基化的P1可与TaIMP-α2在细胞核互作。小麦原生质体中的亚定位分析发现，在野生型Fielder中，P1-GFP与H3-RFP在细胞核中有明显的共定位，而P1N116A-GFP几乎未观察到明显的核内GFP信号；而P1-GFP和P1N116A-GFP在TaIMP-α2敲除突变体中均未观察到明显核定位信号。在TaIMP-α2敲除突变体中回补TaIMP-α2-CFP后，P1-GFP在细胞核中的荧光信号得到明显恢复。此外，田间抗性鉴定发现，TaIMP-α2敲除突变体对WYMV的抗性明显增强（图5）。

图5 TaIMP-α2与P1互作将其转运到细胞核

5. P1N116A触发内质网应激并通过26S蛋白酶体加速其降解

N-糖基化过程与蛋白质的折叠紧密相关，超出内质网加工范围的错误折叠蛋白质的积累可引起内质网应激。qRT-PCR检测发现，P1N116A-GFP表达的叶片中，内质网应激中的标记基因NbBIP和NbbZIP60的表达水平显著上调。研究也检测了接种WYMV或WYMV(P1N116A)的小麦植株中TaBIP、TabZIP28和TabZIP60的表达水平，结果显示与接种前相比，WYMV(P1N116A)侵染下TaBIP和TabZIP60的表达水平明显上调，而WYMV侵染仅引起这两个基因轻微上调（图6）。这表明，非糖基化的P1可能无法正确折叠，从而引发内质网应激。植物通常通过内质网相关降解途径清除错误折叠的蛋白质，以缓解内质网胁迫。半体外降解实验显示，P1N116A-GFP的降解速度明显快于P1-GFP。进一步通过体内外实验分析发现，蛋白酶MG132处理后P1N116A-GFP的蛋白积累量明显恢复（图6）。这表明P1N116A主要通过26S蛋白酶体途径降解。

图6 P1N116A触发内质网应激并通过26S蛋白酶体降解

6. 自然变异的TaOST1B影响了P1的N -糖基化和蛋白稳定性

为了研究自然变异的TaOST1B对P1调控的影响，研究检测了TaOST1B四个单倍型编码蛋白与P1的结合，发现TaOST1BHap1和TaOST1BHap3可以与P1互作，而TaOST1BHap2和TaOST1BHap4则不能与P1互作。此外，研究检测了这四种单倍型对应小麦植株感染WYMV后P1的糖基化修饰丰度。结果发现，与WYMV感染的TaOST1BHap2或TaOST1BHap4基因型小麦植株相比，WYMV感染的TaOST1BHap1或TaOST1BHap3基因型小麦植株中P1的N-糖基化丰度显著增加。进一步分析发现，四种单倍型在18和19位点处存在的氨基酸缺失差异区分了它们对P1的调控作用。通过蛋白质模型模拟发现，该18-19位氨基酸缺失导致了TaOST1B的N端螺旋结构发生构象改变。因此推测，18-19位氨基酸缺失很可能通过改变蛋白质整体折叠的变构效应来削弱TaOST1B与P1的结合能力（图7）。

随后，研究检测了TaOST1B自然变异在小麦感染WYMV时的内质网应激与对P1蛋白质稳定性的影响。结果发现，在WYMV或WYMV(P1N116A)侵染下，TaBiP和TabZIP60在TaOST1BHap4基因型的小麦植株中的表达水平显著上调；而含有TaOST1BHap1基因型的小麦植株中TaBiP和TabZIP60的表达量只在WYMV(P1N116A)侵染下明显上调，在WYMV侵染12 h和24 h时略有上调，在48 hpi时恢复到与侵染前无显著差异。进一步的降解实验表明，P1的降解速度在含有TaOST1BHap1基因型小麦植株中明显低于在含有TaOST1BHap4基因型小麦植株中，添加MG132后，其蛋白积累量明显恢复（图7）。

图7 TaOST1B的自然变异影响P1的N-糖基化和蛋白稳定性

综合以上结果，研究提出了WYMV致病机制的一种模型。在WYMV感染过程中，定位于内质网的感病蛋白TaOST1BHap1能够与WYMV的P1蛋白互作，对其进行N-糖基化修饰，从而促进P1与核转运蛋白TaIMP-α2的结合，增强其在细胞核内的积累。N-糖基化作为P1核转运的特异性信号，确保定位于细胞核的P1与CaMTA3结合，从而干扰CaM3-CaMTA3之间的互作，进而发挥VSR功能，促进WYMV感染。而自然变异体TaOST1BHap4由于无法结合并对P1进行N-糖基化，导致低糖基化的P1在内质网中积累并丧失VSR功能，进而引发内质网应激，通过26S蛋白酶体降解，从而限制WYMV的感染。

本研究由农产品质量安全全国重点实验室（宁波大学）已出站博士后刘佳倩为论文第一作者，陈剑平院士、羊健教授为论文共同通讯作者。宁波大学材化学院质谱研究院唐科奇教授和杨佳倩博士后在N-糖基化修饰检测中给予了技术支持，河南农业大学陈锋教授和已出站博士后石超男在GWAS分析和基因定位中给予了重要指导。河南农业大学王道文教授提供了相关实验材料。本研究获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家小麦产业技术体系、浙江省自然科学基金、浙江省高层次人才项目和中国博士后科学基金的资助。

小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn

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