AbMole丨动物实验荧光染料应用指南：从活体成像到组织切片检测

荧光染料是生命科学研究中不可或缺的工具分子，其应用涵盖活体成像、细胞追踪、血管通透性评估、动物肿瘤转移监测等多个实验。在动物实验中，荧光染料与放射性示踪剂相比，具有操作简便、无辐射危害、可实时动态监测等优势，使其在动物实验中的应用日益广泛。

一、用于动物活体成像的生物发光底物

D-Luciferin potassium是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）的特异性底物，广泛应用于活体生物发光成像。D-Luciferin（CAS No.：115144-35-9）能在荧光素酶、ATP和Mg²⁺存在下发生氧化反应，产生黄绿色光（发射峰约560 nm），其发光强度与荧光素酶表达量及细胞数量呈正相关[1]。D-Luciferin potassium常用于大小鼠肿瘤模型的转移监测（肿瘤移植前需经过基因编辑，以表达荧光素酶）[1]。小鼠活体成像中，D-Luciferin potassium通常通过腹腔注射给药，常用剂量为150 mg/kg（溶于PBS，浓度15 mg/mL），注射体积约100–200 μL/只；注射后5–10分钟发光信号达到峰值，持续约20–30分钟，最佳成像窗口为注射后的10–20分钟。在大鼠模型中，腹腔注射剂量通常为75–150 mg/kg，在成像前需将大鼠麻醉。

范例详解

武汉大学的科研人员在Cell Metabolism文章（IF = 30 ）中将AbMole的D-Luciferin potassium用于CT26luc（表达荧光素酶的直肠癌细胞系）和Panc-02luc（表达荧光素酶的胰腺癌细胞系）的原位移植瘤小鼠模型活体成像，结果表明D-Luciferin potassium有效监测了小鼠肿瘤的生长。

Coelenterazine（腔肠素）是海肾荧光素酶（Renilla luciferase）及多种海洋发光蛋白（如Aequorin）的天然底物，能在海肾荧光素酶催化下产生蓝光（发射峰约480 nm），与萤火虫荧光素酶系统形成光谱互补，能用于双报告基因成像和BRET（生物发光共振能量转移）研究[2]。Coelenterazine（CAS No.：56-47-3）在动物实验中通常通过腹腔或静脉注射给药（常用剂量2–10 mg/kg）。Coelenterazine 还是一种超氧阴离子敏感的化学发光探针，能在不需要海肾荧光素酶的条件下与超氧阴离子直接反应，产生发光物，其荧光强度与超氧阴离子浓度成正比。Coelenterazine的衍生物（如Coelenterazine h 、Coelenterazine 400a）具有不同的光谱特性和动力学特征，可根据实验需求选择。

范例详解

AbMole的Coelenterazine作为荧光素酶底物，配合IVIS活体成像系统，在C57BL/6J小鼠的LLC肺原位移植模型中，实时监测了肿瘤相关成纤维细胞外泌体促进非小细胞肺癌增殖和转移的过程。

二、用于动物活体成像的近红外荧光染料

DiR是一种长链碳菁染料，其激发/发射波长约为748/780 nm，处于近红外窗口（NIR-I，700–900 nm），具有较深的组织穿透能力和较低的生物组织自发荧光背景[3]。DiR iodide（CAS No.：100068-60-8）的疏水性使其能够非共价插入细胞膜脂质双层，广泛用于细胞标记、纳米粒子示踪及活体成像。在体外细胞标记时，一般将细胞与DiR工作液（常用浓度1–5 μM）在37°C条件下孵育30分钟左右即可完成标记，标记后的细胞通过尾静脉注射（常用剂量1×10⁶–5×10⁶个细胞/只，注射体积100–200 μL）或局部移植（如皮下、原位）导入动物体内。对于纳米粒子标记，DiR可通过共封装或表面修饰方式负载于脂质体或者聚合物纳米粒中，常用浓度为0.1%–1%（w/w），标记后通过尾静脉注射给药，可利用活体成像系统追踪纳米粒子在动物的体内分布和肿瘤靶向效率[4]。

范例详解

苏州大学的科研人员在Bioactive Materials文章（IF = 20）中使用AbMole的DiR染色中性粒细胞膜包覆的纳米颗粒，随后该纳米颗粒被用于SD大鼠尾椎椎间盘退变（IVDD）模型的局部注射。活体成像结果表明DiR有效追踪了纳米颗粒在体内的稳定性，以及在椎间盘局部的滞留和缓释效果。

IR-808是一种新型近红外七甲氨酸菁染料，其激发/发射波长约为782/808 nm，处于近红外窗口，兼具光热转换和光动力效应，在动物的肿瘤成像和光热研究中具有独特优势。IR-808（CAS No.：172971-76-5）在小鼠肿瘤移植模型中一般通过尾静脉注射给药（常用剂量0.5–2 mg/kg，溶于生理盐水或PBS，体积100–200 μL），注射后2–24小时可利用近红外成像系统（激发780 nm，收集滤光片>800 nm）进行动态成像[5]。光热研究中，IR-808在小鼠注射后的4–8小时，以808 nm激光照射肿瘤部位（功率密度0.5–2 W/cm²，照射时间5–10分钟），肿瘤局部温度可升至45–55°C，该反应能诱导肿瘤细胞热消融[6]。

范例详解

广州医科大学的科研人员在Signal Transduction and Targeted Therapy文章（IF = 81.2）中将AbMole的IR-808用于前列腺癌皮下移植瘤裸鼠模型的活体荧光成像、光热成像及生物分布研究。研究者通过尾静脉注射负载IR-808的纳米颗粒，结果显示，纳米颗粒在肿瘤部位表现出显著的富集能力，荧光信号可持续检测至96小时；离体器官成像进一步证实了纳米颗粒在肿瘤组织中的优先滞留。红外热成像仪（FOTRIL 22OS）对肿瘤部位进行光热成像监测，显示在808 nm激光照射（功率密度0.8 W/cm²）下，肿瘤部位升温明显，局部组织达42℃（图4）。

CY7是另一种常用的近红外七甲氨酸菁染料，激发/发射波长约为750/776 nm，广泛用于活体成像和流式细胞术。CY7（CAS No.：943298-08-6）的衍生物如CY7-SE可与抗体、多肽或纳米粒子共价偶联，实现靶向成像[7]。

Indocyanine green（ICG）是一种动物实验中常用到的近红外造影剂和荧光染料，广泛用于血管成像、肝功能评估及活体成像。ICG（CAS No.：3599-32-4）进入动物体内后能迅速与血浆蛋白结合，被限制在血管内，极少渗漏到血管外间隙，因此是理想的血管造影剂。在大小鼠的活体成像中，ICG（吲哚菁绿）一般通过尾静脉注射（小鼠常用剂量1–10 mg/kg），注射后30分钟内进行近红外成像，可实时观察血管网络、淋巴引流及肿瘤血液循环供给。Indocyanine green还可用于光热研究，其在动物肿瘤组织富集后，在808 nm激光照射下能产生局部高温，实现成像引导的光热消融[8]。ICG还能通过负载的方式，标记纳米材料（如脂质体）并在实验动物体内进行活体成像，以对纳米材料进行示踪分析。

范例详解

AbMole的Indocyanine green（ICG，吲哚菁绿）被用于肝纤维化小鼠模型的活体成像和药代动力学研究，实验人员通过静脉注射负载ICG的纳米颗粒以评估该纳米粒子的体内生物分布和肝脏富集情况，活体成像结果表明ICG信号可持续48小时以上（图5）。

三、动物实验中其它功能性染料

Methoxy-XO4是一种能穿越血脑屏障的荧光染料，属于刚果红衍生物，对β-折叠片层结构具有高度亲和力，可特异性结合淀粉样蛋白沉积（如Aβ斑块、tau缠结），在阿尔茨海默病动物模型的离体检测中具有重要应用。Methoxy-XO4（CAS No.：863918-78-9）的激发/发射波长约为370/452 nm，一般先进行动物注射，然后解剖出脑组织并切片成像[9]。

范例详解

AbMole的Methoxy-XO4被用于阿尔茨海默病APP-KI/Fit2iΔMφ转基因小鼠模型的体内β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）吞噬功能评估。研究者通过腹腔注射Methoxy-XO4（剂量8 mg/kg），利用其能够穿越血脑屏障并特异性标记Aβ斑块的特性，在注射3小时后分离小胶质细胞，通过流式细胞术检测Methoxy-XO4阳性细胞比例，以定量评估FIT2敲除后小胶质细胞对Aβ斑块的吞噬能力（图6）。

Thioflavin T（硫黄素T）也是检测淀粉样蛋白聚集的经典荧光染料，其作用机理是与β-淀粉样蛋白结合后荧光强度显著增强（激发/发射波长约450/482 nm），广泛用于体外和离体样本的蛋白聚集检测。Thioflavin T（硫黄素T）的最大激发波长：~385 nm (游离)；~450 nm (结合淀粉样蛋白)；最大发射波长：~445 nm (游离)；~485 nm (结合淀粉样蛋白)。与Methoxy-XO4类似，Thioflavin T（CAS No.：2390-54-7）因激发波长较短而不适合动物的活体成像，但可用于动物实验中的离体组织，特别是脑组织切片检测[10]。

TMB（BM blue）是酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫组化中最常用的显色底物，它与辣根过氧化物酶（HRP）反应后产生蓝色产物（最大吸收波长370 nm和650 nm），加入终止液（如2 M H₂SO₄）后变为黄色（最大吸收波长450 nm）。TMB（CAS No.：54827-17-7）的反应灵敏度高，检测范围可达pg/mL级别，是细胞和动物实验中细胞因子、抗体及蛋白定量检测的常用底物之一。

品名· 编号· 检测与用途· Ex (nm)· Em(nm)

D-Luciferin potassium· M8873· 动物体内成像· · 560

FITC-Dextran (MW 4000)· M9390· 细胞凋亡、细胞渗透性· 488· 525

DiR· M5122· 细胞膜· 748· 780

Indocyanine green· M3577· 血管造影· 782· 808

Diphenylterazine· M10647· 动物体内成像· · 460

Thioflavine S· M13803· 淀粉样蛋白· 450· 485

Coelenterazine· M9267· 动物体内成像· · 465~480

AkaLumine· M13768· 动物体内成像· · 677

Texas Red· M7339· 神经元形态· 586· 605

Lucifer Yellow CH dipotassium· M11111· 神经细胞· 450· 650

IR-820· M56904· 动物体内成像、造影剂· 800· 820

IR-808· M11151· 动物近红外成像、光敏剂· 775· 800

Methoxy-XO4· M6952· 在体Aβ蛋白和Tau缠结成像· 340· 452

Thioflavin T· M10117· 组织切片Aβ蛋白检测· 450· 485

Thioflavine S· M13803· 组织切片Aβ蛋白检测· 450· 485

Congo Red· M11412· 组织切片Aβ蛋白检测· /· /

TMB· M9269· 免疫组化/ELISA底物、ROS探针· /· /

Toluidine Blue O· M30918· 组织切片染色· /· /

Chlorin E6· M9297· 光敏剂、荧光染料· 402/662· 668

N-Methylmesoporphyrin IX· M55983· G-四链体DNA探针、Aβ蛋白染料· 399· 610

参考文献及鸣谢

[1] Contag, C. H.; Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering 2002, 4, 235-260.

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[3] Kalchenko, V.; Shivtiel, S.; Malina, V.; et al. Use of lipophilic near-infrared dye in whole-body optical imaging of hematopoietic cell homing. Journal of biomedical optics 2006, 11 (5), 050507.

[4] Avgoustakis, K. Pegylated poly(lactide) and poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles: preparation, properties and possible applications in drug delivery. Current drug delivery 2004, 1 (4), 321-333.

[5] Chen, Q.; Liang, C.; Sun, X.; et al. H(2)O(2)-responsive liposomal nanoprobe for photoacoustic inflammation imaging and tumor theranostics via in vivo chromogenic assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2017, 114 (21), 5343-5348.

[6] Sheng, Z.; Hu, D.; Zheng, M.; et al. Smart human serum albumin-indocyanine green nanoparticles generated by programmed assembly for dual-modal imaging-guided cancer synergistic phototherapy. ACS nano 2014, 8 (12), 12310-12322.

[7] Luo, S.; Zhang, E.; Su, Y.; et al. A review of NIR dyes in cancer targeting and imaging. Biomaterials 2011, 32 (29), 7127-7138.

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[9] Mathis, C. A.; Bacskai, B. J.; Kajdasz, S. T.; et al. A lipophilic thioflavin-T derivative for positron emission tomography (PET) imaging of amyloid in brain. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2002, 12 (3), 295-298.

[10] LeVine, H., 3rd. Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution. Protein science : a publication of the Protein Society 1993, 2 (3), 404-410.