JBC | 华进联/李娜团队：银杏内酯A靶向细胞色素c抑制内源性凋亡，促进多能干细胞向心肌细胞分化

心肌梗死之所以难以有效治疗，根本原因在于成年心肌细胞的再生能力极为有限。利用人多能干细胞定向诱导分化为心肌细胞，是目前补充受损心肌最具前景的策略之一。然而，这一方向在临床转化与规模化制备中长期面临两大难题：分化效率不稳定，以及分化过程中大量细胞发生凋亡，终末细胞产量大打折扣。尤其在干细胞开始向心脏谱系特化的关键过渡阶段，程序性细胞死亡极易被触发，进一步制约了有效细胞的获得。

银杏叶中提取的二萜内酯类化合物银杏内酯A（Ginkgolide A, GA）此前已被报道具有心脏保护活性，并可通过激活PI3K/Akt通路、缓解内质网应激等机制抑制神经元和内皮细胞的凋亡。但GA是否直接影响多能干细胞向心肌细胞的分化进程，以及其背后的具体分子机制，一直未被阐明。

近日，西北农林科技大学动物医学院华进联课题组在Journal of Biological Chemistry上发表了题为Ginkgolide A Enhances Cardiomyocyte Differentiation from Pluripotent Stem Cells by Targeting Cytochrome c to Attenuate Intrinsic Apoptosis的研究论文。研究团队综合运用表型筛选、转录组学与计算生物学手段，揭示了GA直接靶向细胞色素c（CYC）并抑制内源性线粒体凋亡通路，从而显著提升多能干细胞向心肌细胞分化效率的新机制。

为高效筛选影响心肌分化的活性化合物，研究者首先利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在人多能干细胞的TNNT2基因终止密码子前框内敲入H2B-mCherry-PuroR序列，构建了TNNT2-mCherry报告细胞系。TNNT2编码心肌肌钙蛋白T，是心肌细胞分化成熟的关键标志物，其表达上调可直接反映分化进程。流式细胞术分析表明，该报告细胞系在分化第10天的心肌诱导效率可达80%以上，与未编辑的胚胎干细胞相当。免疫荧光染色显示，因H2B标签而呈现核定位的mCherry红色荧光与TNNT2、NKX2-5及ISL1等心肌特异性标志蛋白完全共定位。这一报告系统的成功构建，为后续银杏内酯类化合物的筛选提供了可靠的实时监测平台。

在此基础上，研究团队选取银杏内酯家族中三个代表性成员——GA（含一个羟基）、GB（含两个羟基）和GK（含两个羟基及额外的碳碳双键）——在分化全程分别以50 μM和100 μM浓度进行处理。结果表明，GA和GB均可显著提高心肌诱导效率，而GK未呈现明显效果。值得注意的是，在100 μM和150 μM浓度下，GA处理组的细胞团出现自发搏动的时间提前至第5天。免疫荧光与流式细胞术定量分析一致证实，GA可显著上调心脏核心转录因子NKX2-5及心肌结构蛋白TNNT2的表达水平。

为探究GA促进心肌分化的内在机理，研究者将目光集中于细胞凋亡。利用Annexin V与活化Caspase-3双染结合流式细胞术进行分析，在未处理对照组的分化第5天，凋亡细胞比例高达34.2%，而经100 μM和150 μM GA处理后，该比例分别降至16.8%和8.5%。Western blot检测进一步显示，切割型PARP、切割型Caspase-9和切割型Caspase-3的水平随GA浓度升高呈剂量依赖性降低。引人注意的是，BCL2与BAX蛋白表达量并无显著变化，这提示GA的抗凋亡效应并非经由传统的BCL2/BAX通路所介导。与此同时，GA处理还上调了心脏中胚层标志物MESP1（第4天）以及心脏祖细胞标志物NKX2-5和ISL1（第5天）的表达。然而，当GA浓度增至200 μM时，心脏中胚层标志物的表达反而受到抑制，这一现象暗示，适度的凋亡对于正常的谱系定型具有生理必要性，完全消除凋亡反而可能干扰发育程序的正常进行。

为了全景式地揭示GA的作用机制，研究者在心脏中胚层（第4天）、心脏祖细胞（第5天）和早期心肌细胞（第6天）三个关键分化节点进行了转录组测序。主成分分析显示，GA对未分化多能干细胞的转录组影响甚微，但在心脏祖细胞和早期心肌细胞阶段，基因表达谱却发生了显著重塑，表明GA的调控作用具有严格的发育阶段依赖性。GO富集分析鉴定出多个与凋亡过程相关的基因簇，抗凋亡基因如MCL1、XIAP、BIRC5、BCL2和BCL2L1等在GA处理后均发生上调；同时，核心心肌转录因子NKX2-5、TBX5、GATA4和ISL1的表达亦显著升高。GSEA分析进一步确认，凋亡相关通路在GA处理的心脏祖细胞和早期心肌细胞中均呈现显著富集，且后者的富集程度更为突出。此外，KEGG与GO分析还发现，GA不仅影响凋亡与心肌分化相关通路，还波及“干细胞多能性调控信号通路”“ATP依赖的染色质重塑”“肌细胞骨架”等生物学过程，并延伸至RNA剪接和mRNA加工等表观调控层面，提示GA很可能参与了心肌命运决定过程中的代谢重塑。

在蛋白质水平上，GA使Caspase-9、Caspase-3及PARP的切割均减少，但其直接作用靶点仍需明确。研究团队利用PharmMapper与DrugCLIP进行反向药效团匹配，并结合GO/KEGG富集分析，将靶点锁定于细胞色素c——内源性线粒体凋亡通路的核心分子。细胞色素c自线粒体释放后，与凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）结合，启动凋亡小体组装并激活Caspase-9级联反应。分子对接预测显示，GA与细胞色素c可以形成稳定结合，预测结合自由能为-5.4 kcal/mol。GA的C10位羰基氧分别与细胞色素c的Lys27侧链（氢键距离3.5 Å）及Ser15（氢键距离2.2 Å）形成氢键，该结果亦经LigPlot⁺分析所确认。更为关键的是，研究团队运用AlphaFold3预测了细胞色素c与APAF-1的复合物结构，叠加分析揭示，GA的结合位点与细胞色素c/APAF-1互作界面高度重叠。细胞色素c上参与APAF-1结合的关键残基（如Lys25、Lys27、Gln16）恰好位于GA所占据的区域附近。APAF-1表面的酸性残基簇与细胞色素c的碱性残基簇之间原本依赖静电互补和氢键网络实现高亲和力结合，GA的插入很可能通过空间位阻和氢键网络扰动，削弱了细胞色素c对APAF-1的识别与结合，从而阻断凋亡信号的向下传导。鉴于细胞色素c与APAF-1自身的结合亲和力极高（超低盐条件下结合常数超过10¹¹ M⁻¹，对应结合自由能约-15.6 kcal/mol），GA发挥效应的主要窗口期应位于细胞色素c尚未与APAF-1结合之前，这与实验中自分化起始即添加GA的处理策略完全吻合。

综合以上发现，该研究提出了一种清晰的机制模型：GA直接靶向细胞色素c，干扰其与APAF-1的相互作用，从而抑制内源性线粒体凋亡通路，显著减少分化过程中的细胞凋亡；同时，抗凋亡基因与核心心肌转录因子的协同上调共同构筑了一个促存活、促分化的微环境，最终大幅提高了多能干细胞向心肌细胞的分化效率。从应用角度看，GA作为银杏叶来源的天然纯化产物，相较于合成化合物在法规监管方面具备天然优势。若将其作为细胞培养添加剂，应用于干细胞规模化扩增与定向分化过程中，有望有效降低细胞损失，提升终产品得率，为基于干细胞的再生医学及生物制造提供一种安全、高效的新方案。该研究不仅为理解天然产物调控细胞命运提供了新视角，也为现代细胞技术与传统中药资源的交叉融合开辟了新的路径。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jbc.2026.113224

制版人：十一

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