FSHW | 类植物乳杆菌发酵工业大麻籽中新型抗炎肽的鉴定与分子对接机制

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Abstract

炎症反应是一种关键的生理过程，但其过度或持续激活可导致组织损伤，并被认为是多种慢性疾病（如类风湿性关节炎）的重要致病因素。近年来，研究逐渐聚焦于挖掘来源于Cannabis sativa L.（工业大麻）种子的高价值营养成分，尤其是工业大麻籽蛋白。因此，本研究旨在探究类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum）发酵过程中工业大麻籽蛋白中抗炎肽的释放情况。

为确认发酵过程中工业大麻籽蛋白是否被完全水解，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。随后，通过超滤技术对肽段进行分离与纯化，并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（UHPLC-QTOF-MS）对肽段进行鉴定。结果显示，在发酵工业大麻籽中共鉴定出39种肽段，并根据其相对含量筛选出9种代表性肽。

其中，AAELIGVP（P1）、AAVPYPQ（P2）、VFPEVAP（P4）、DVIGVPLG（P6）和PVPKVL（P9）在脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞模型中表现出显著的抗炎活性。进一步采用分子对接技术探讨上述5种肽的潜在抗炎机制，生物信息学分析结果表明，P1、P2、P4、P6和P9可与Toll样受体4（TLR-4）、核因子-κB（NF-κB）及NF-κB抑制蛋白激酶（IKK）的活性位点发生结合，并表现出较高的结合能。

综上所述，本研究结果表明，工业大麻籽具有作为功能性食品中抗炎生物活性肽来源的潜在应用价值。

Introduction

炎症在多种慢性疾病的发生发展中起着关键作用。炎症反应调控失衡可引发心血管、神经系统、肠道疾病、类风湿性关节炎以及癌症等多种疾病。在炎症过程中，细胞水平的炎症信号通路被认为是疾病发生的重要分子基础，其中核因子κB（NF-κB）通路是最经典的炎症信号通路之一。该通路可被肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）及一氧化氮（NO）等促炎因子激活，进而启动IKK复合物，引发IκBα的磷酸化和降解，使NF-κB进入细胞核并促进多种炎症介质的转录。此外，TLR及其下游的TRAF蛋白通过调控NF-κB信号通路，在炎症介质的大量释放及炎症相关疾病的发生中发挥关键作用。

近年来，天然抗炎活性物质的开发逐渐成为研究热点。工业大麻（Cannabis sativa L.）因其成分多样性而被认为具有良好的抗炎潜力。工业大麻种子富含蛋白质、脂肪酸、维生素和矿物质，其蛋白质具有优良的氨基酸组成和消化性，营养价值甚至优于大豆蛋白。研究表明，工业大麻籽蛋白衍生肽具有抗炎、抗氧化等多种生物活性，但其具体活性肽组成及结构特征仍有待深入研究。

发酵是一种利用微生物酶系将大分子有机物转化为小分子肽和氨基酸的高效手段，不仅可提高工业大麻制品的营养价值，还能增加多种具有益生元和生物活性的成分。乳酸菌发酵已被成功应用于乳制品、大豆和油菜籽等原料中，用于制备生物活性肽。然而，不同菌株及发酵条件会显著影响所释放肽段的类型和活性，因此筛选合适的菌株对获得高活性肽至关重要。

基于前期研究结果，本研究发现类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum）发酵的工业大麻种子具有显著抗炎活性。因此，本研究以该菌株发酵工业大麻种子为研究对象，利用UHPLC-QTOF-MS鉴定发酵产物中的肽段，筛选并合成潜在抗炎肽，通过体外实验验证其抗炎活性，并结合分子对接技术预测其与炎症相关信号通路蛋白的相互作用机制。本研究首次鉴定并表征了9种来源于发酵工业大麻种子的全新抗炎肽，为其在功能食品领域的应用提供了理论依据。

Results

原始工业大麻种子与发酵工业大麻种子的蛋白质图谱分析

SDS-PAGE被用于分析工业大麻种子在发酵前后蛋白质组成的变化情况（图1）。该方法可根据分子量差异对蛋白质进行分离，从而直观反映蛋白水解程度。

随着L. paraplantarum发酵时间的延长（12、24和48 h），各蛋白条带强度逐渐减弱，其中48 h发酵后几乎无法检测到明显蛋白条带（图1）。该结果表明，工业大麻种子蛋白在发酵过程中被充分水解，转化为分子量较小的肽段。结合既往研究推测，这些释放的中小分子肽（＜20 kDa）具有潜在的生物活性，如抗炎和抗肿瘤活性。因此，L. paraplantarum发酵显著改变了工业大麻种子的蛋白质谱型，为生物活性肽的生成提供了有利条件。

图1 SDS-PAGE凝胶上显示的原始工业大麻种子蛋白及其经L. paraplantarum发酵产生的水解产物的蛋白质图谱

合成肽对炎症反应的影响

采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞作为体外炎症模型，评价所筛选肽段的抗炎活性（图2）。在抗炎实验前，通过EZ-Cytox法检测肽段的细胞毒性。结果显示，在0～500 μg/mL浓度范围内，所有肽段均未显著降低细胞活力（图2A），说明其具有良好的生物安全性。

与正常细胞相比，LPS刺激显著提高了RAW264.7细胞中NO、TNF-α和IL-1β的分泌水平（图2B–D）。在肽处理组中，多个肽段明显抑制了上述炎症因子的产生，其中P1、P2、P4、P6和P9表现出更为显著的抗炎效果。这些结果表明，富含丙氨酸和脯氨酸残基的肽段在抑制炎症介质释放方面具有较强能力，进一步支持了工业大麻种子作为抗炎活性肽来源的潜力。

图2 所筛选肽段（P1–P9）的抗炎活性分析

抗炎肽与TLR-4、NF-κB和IKK的分子对接分析

为探讨抗炎肽的作用机制，本研究采用分子对接方法分析活性肽与炎症信号通路关键蛋白TLR-4、NF-κB和IKK之间的相互作用（图3）。分子对接结果显示，P1、P2、P4、P6和P9均可稳定结合于上述蛋白的活性位点，其结合能均低于-5 kcal/mol，表明这些肽段与靶蛋白之间具有较强的亲和力。

进一步分析发现，这些肽主要通过氢键和疏水相互作用与目标蛋白结合（图3A–O）。结合细胞实验结果推测，这些相互作用可能抑制NF-κB信号通路的激活，从而减少下游促炎因子的表达（图2）。此外，富含疏水性氨基酸及谷氨酰胺的肽段通常表现出更优的结合能力，这与既往关于抗炎肽结构特征的研究结果一致。

图3 炎症通路相关蛋白与潜在抗炎活性肽的对接构象及相互作用的三维和二维示意图

Conclusion

本研究表明，L. paraplantarum发酵能够显著促进工业大麻种子蛋白的水解，生成多种具有抗炎潜力的低分子量肽。最终鉴定并合成了5种新型抗炎肽（AAELIGVP、AAVPYPQ、VFPEVAP、DVIGVPLG和PVPKVL），其在细胞模型中可有效抑制TNF-α、IL-1β和NO的产生，并在分子对接分析中与TLR-4、NF-κB和IKK表现出良好的结合能力。

尽管发酵法在活性肽稳定生产方面仍面临一定挑战，但本研究为发酵工业大麻种子来源抗炎肽在功能食品领域的开发提供了重要的理论依据和应用前景。

Identification and molecular docking mechanism of novel anti-inflammatory peptides from Lactobacillus paraplantarum fermented Cannabis sativa L. (hemp) seeds

Lingyue Shana,b, Akanksha Tyagia, Hun Ju Hamc, Deog Hwan Oha,b,*

a Department of Food Science and Biotechnology, College of Agriculture and Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Republic of South Korea

b Future F Biotech Co., Ltd., Chuncheon 24341, Republic of South Korea

c Department of Biological Environment, College of Agriculture and Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic of South Korea

*Corresponding author.

Abstract

The inflammatory response is a crucial physiological process that can lead to tissue damage and is considered a causative factor for various chronic diseases, such as rheumatoid arthritis. Recent research has focused on exploring valuable nutrients derived from Cannabis sativa L. (hemp) seeds, particularly hemp seed proteins. Therefore, this study aimed to investigate the release of anti-inflammatory peptides from Lactobacillus paraplantarum-fermented hemp seed proteins. To confirm the complete hydrolysis of hemp seed proteins during the fermentation process, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was employed. Further, the isolation and purification of peptides were achieved through ultrafiltration. The identity of peptides was nextly established using ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-QTOF-MS). The results revealed a total of 39 identified peptides in fermented hemp seeds, with 9 peptides selected based on their relative quantity. Notably, AAELIGVP (P1), AAVPYPQ (P2), VFPEVAP (P4), DVIGVPLG (P6), and PVPKVL (P9) demonstrated strong anti-inflammatory abilities in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 macrophage cells. Molecular docking was used to understand the potential anti-inflammatory mechanism of these 5 peptides, and in silico results indicated that P1, P2, P4, P6, and P9 could bind to the active sites of toll-like receptor 4 (TLR-4), nuclear factor-κB (NF-κB), and inhibitor of NF-κB kinase (IKK) with higher binding energies. Overall, these findings indicate that hemp seeds have potential to be a source of bioactive peptides for functional foods with anti-inflammatory properties.

Reference:

SHAN L Y, TYAGI A, HAM H J, et al. Identification and molecular docking mechanism of novel anti-inflammatory peptides from Lactobacillus paraplantarum fermented Cannabis sativa L. (hemp) seeds[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250161. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250161.

翻译： 王小云（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：摄图网

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