以mRNA脂质纳米颗粒为基础的体内CAR-T细胞

引言

嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法已彻底改变了血液恶性肿瘤的治疗，然而其更广泛的应用，特别是在实体瘤中，仍然受到高成本、劳动密集型制造、有限的生产能力以及不稳定的临床疗效的限制，同时也面临诸如归巢能力差、抗原异质性和免疫抑制性肿瘤微环境等障碍。体内CAR-T细胞工程，即在患者体内直接生成CAR-T细胞，通过消除体外细胞处理和复杂物流基础设施的需求，提供了一种范式转变。在新兴方法中，信使RNA（mRNA）负载的脂质纳米颗粒（LNPs）已成为一种有前景且临床可行的体内CAR-T细胞生成平台。

一、mRNA生物学与LNP递送平台

用于CAR-T细胞生成的现代mRNA构建体整合了多层次的序列和结构优化。这些通常包括：一个支持高效帽依赖性翻译起始的合成5′帽类似物；精心挑选的源自高翻译内源转录本（例如，α-珠蛋白或爪蟾β-珠蛋白）的5′和3′非翻译区，以促进稳定性和核糖体加载；开放阅读框的密码子优化，以与人类密码子使用偏好对齐并最小化抑制性序列；一个约100-150个核苷酸的多聚腺苷酸（poly(A)）尾，以增强稳定性并促进核糖体循环；以及系统性地掺入修饰核苷，特别是m1Ψ，以减弱Toll样受体信号传导并减少I型干扰素诱导。总的来说，这些工程策略将治疗性mRNA的有效半衰期从几分钟延长到几小时或几天，并大幅增加了每个递送分子产生的蛋白质量，这些特性对于有效的体内CAR表达至关重要。

脂质纳米颗粒（LNPs）是目前系统性递送mRNA最有效的模态，标准的LNP配方包含四种脂质成分，每种成分都发挥特定的生物物理功能。可电离脂质是最关键的设计元素，包含一个可滴定的胺基团，其表观pKa通常在6.0-6.5之间。在此范围内，可电离脂质在生理pH（7.4）下主要保持中性，从而减少非特异性静电相相互作用和系统性毒性。当内体腔室内的pH下降至约5.0-5.5时，这些胺基团被质子化，赋予正电荷并促进“锥形”脂质几何构象，破坏内体膜并促进mRNA载体释放到细胞质中。

辅助磷脂如DOPE或DSPC提供双层的结构支架并调节膜流动性。胆固醇插入磷脂之间，填充堆积缺陷，增强颗粒稳定性，并已被证明支持内体逃逸。聚乙二醇（PEG）-脂质结合物包被LNPs的外表面，通过创建亲水性屏障防止颗粒聚集、减少调理作用并延长循环时间。LNPs由封装在可电离脂质、磷脂、胆固醇和PEG-脂质中的mRNA组成。细胞摄取后，LNPs离开内体，将mRNA释放到细胞质中，实现翻译，并诱导T细胞表面CAR表达。

对于T细胞靶向应用，常规LNP的固有肝趋向性是一个必须克服的主要限制。对可电离脂质化学进行系统性修改、调整脂质成分比例以及掺入所谓的选择性器官靶向（SORT）脂质，可以将LNP生物分布从肝脏转向淋巴器官和循环免疫细胞。

二、工程化T细胞靶向LNPs

对于基于LNP的方法，有效的T细胞编程需要颗粒能够在循环中存留足够长时间以遇到相关T细胞群体，通过高亲和力相相互作用与T淋巴细胞表面标志物例如C3、CD4、CD5或CD8选择性结合，并通过受体内吞作用高效内化进入这些细胞，以实现稳健的内体逃逸，将功能性mRNA递送到细胞质。

T淋巴细胞对非病毒核酸的递送构成了重大障碍。静息T细胞是小而活跃、非吞噬细胞的细胞，内吞受体水平低。这与快速分裂的肝细胞或肿瘤细胞不同。它们高效的DNA修复系统和核输入限制进一步阻碍了质粒DNA的递送。mRNA不需要核进入的要求，使其成为T细胞重编程的最佳载体。

抗-CD3和抗-CD8抗体：CD3是T细胞受体的恒定信号传导复合物，仅在T淋巴细胞上表达，使其成为主动递送的有吸引力的靶抗原。靶向CD8同样可以实现选择性递送至细胞毒性T淋巴细胞，即抗肿瘤免疫中的主要效应细胞。由于CD4⁺辅助T细胞也有助于肿瘤控制并维持CAR-T持久性，当需要广泛的T细胞重编程时，通常优先使用针对CD3或CD2的泛T细胞策略。CD5也已作为靶抗原被探索；CD5靶向的LNPs在体内能够有效转染T细胞，并驱动CAR表达达到足以在淋巴瘤模型中诱导抗肿瘤活性的水平。

纳米抗体和单域抗体：骆驼科单域抗体由于其小尺寸（约15kDa）、高稳定性以及易于遗传和化学工程化的特点，非常适合LNP表面功能化。分选酶介导的连接和马来酰亚胺-硫醇偶联已被用于将特异性针对CD7的纳米抗体偶联到可电离LNPs上。

受体特异性配体和LFA-1靶向：结合T细胞限制性表面受体的肽和小分子为基于抗体的方法提供了有吸引力的替代方案，特别是从制造角度。淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1），即在T细胞上丰富表达的整合素αL/β2异二聚体，已被利用于使用LABL（一种源自ICAM-1的肽）进行选择性LNP靶向。LABL功能化的LNPs显示出对T细胞的优先结合和内化，表明短肽配体可以有效地调整LNP趋向性，无需完整的抗体结合。

被动靶向与SORT技术：LNP生物分布也可以仅通过调整脂质组成来调节。选择性器官靶向（SORT）技术表明，向原本常规的四组分LNPs中引入第五种脂质成分（通常是永久带电的阳离子或阴离子脂质），可以系统地重新调整器官趋向性，根据SORT脂质的身份和比例将递送重定向到肺、脾或肝。在此框架中，脾脏靶向的SORT LNPs优先转染脾脏T淋巴细胞，提供了一条相对简单的免疫细胞靶向途径。

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三、用于mRNA递送的CAR构建体设计

经典嵌合抗原受体（CAR）是一种合成的I型跨膜蛋白质，由四个功能模块组成。细胞外抗原结合结构域通常源自肿瘤抗原特异性抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），配置为单链可变片段（scFv）。一个铰链或间隔区将该结合结构域连接到膜，并提供灵活性，从而影响表位可达性和靶点结合的最佳细胞间距离。跨膜结构域将受体锚定在T细胞膜中，并可调节受体稳定性和信号传导。最后，一个或多个细胞内信号传导结构域在抗原结合后传递激活信号。

由于mRNA天然是短寿命的，即使经过核苷修饰和3'UTΩ优化，其有效半衰期也在约12-72小时量级，mRNA编码的CAR提供了一个明确的效应活性窗口，随后表达自发丧失。这一特性提供了一个明显的安全性优势，通过消除插入突变发生风险和长期靶向非肿瘤毒性。同时，它也带来了一个药理学挑战：必须在治疗窗口内使T细胞达到足够的CAR表面密度，并且必须为需要持续抗原压力的肿瘤设计再给药策略。

目前，多种方法正在探索中，以延长mRNA-CAR表达的持续时间和幅度。环状RNA（cirRNA）本质比线性mRNA更稳定，因为它缺少核酸外切酶通常识别的5′帽和聚(A)尾，因此可以支持单次递送事件产生持续蛋白质生产。自扩增RNA（sRNA）编码了病毒复制机器和CAR转基因，使得RNA模板能在细胞内扩增以及蛋白质自非常小的输入剂量起持续表达，通常持续数周。在体内CAR-T应用中，实际上，环状RNA和自扩增RNA都可以作为常规线性mRNA的下一代替代品。

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四、mRNA-CAR-T的临床转化与监管

体内mRNA-CAR-T技术的临床前成功催化了大量投资和早期临床活动，特别是在专注于靶向LNP平台的生物技术公司中。Capstan Therapeutics、Sana Biotechnology以及几家学术衍生公司已经披露了多项申请IND的项目并启动了首次人体试验，以测试体内T细胞重编程策略。这些项目中的大多数目前处于IND或I期剂量爬坡阶段，Capstan Therapeutics特别强调了靶向mRNA-LNPs的开发，旨在体内生成CD19导向的CAR-T细胞；人源化模型中的临床前数据证明了选择性T细胞转染和稳健的抗肿瘤活性。

体内mRNA-CAR-T疗法的监管借鉴了基因治疗产品和体外CAR-T细胞的现有框架，但并未完全与之重叠。在当前的美国和欧盟范式下，LNP-mRNA作为生物制品进行监管，而体内产生的CAR-T细胞则构成基因修饰的体细胞治疗。这种双重性质引发了关于如何定义“产品”、什么是适当的放行标准，以及当活性细胞药物在患者体内产生时如何评估效力的新问题。

诸如FDA的生物制品评估和研究中心（CBER）以及欧洲药品管理局（EMA）等监管机构正开始通过指南更新和监管科学倡议来解决这些问题，通常类比于体内基因治疗和传统CAR-T框架。核心期望包括：证明一致的LNP制造（粒径分布、包封效率、mRNA完整性和靶向配体结合效率）；对患者样本中体内生成的CAR-T细胞的表型和功能进行详细表征；对CAR表达和扩增的药代动力学和药效学进行定量建模；以及全面的安全性评估，包括基因毒性和插入风险，即使对于非整合mRNA平台，也要强有力地排除意外的核递送或脱靶基因组修饰。

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五、mRNA-CAR-T的挑战与局限

特异性和脱靶：实现足够的细胞特异性可以说是体内mRNA-CAR-T疗法的核心挑战。当前的T细胞靶向LNPs显示出明显的优先被T淋巴细胞摄取，但它们始终不同程度地转染非靶细胞。肝细胞、专业抗原呈递细胞、自然杀伤细胞和其他先天免疫细胞可以通过Fc受体结合、非特异性内吞摄取来内化靶向LNPs。不过，mRNA表达的瞬时性限制了此类脱靶效应与整合载体相比的持久性。一个额外的担忧是CAR表达于调节性T细胞，这可能减弱抗肿瘤免疫。为了解决这些问题，正在探索多种策略以将体内转染偏向细胞毒性CD8⁺ T细胞，远离抑制性T细胞亚群。

LNPs和mRNA的免疫原性：尽管进行了广泛的核苷修饰，mRNA-LNP仍持续与先天免疫传感器相互作用，包括不依赖于TLR的胞质RNA受体如RIG-I和MDA5，以及NLRP3炎症小体。由于CAR表达来自mRNA是瞬时的，大多数体内平台需要重复给药，这引发了对累积炎症毒性和随着时间推移产生抗LNP免疫的担忧。

制造与可扩展性：尽管体内mRNA-CAR-T疗法避免了患者特异性细胞制造，但它引入了在RNA和纳米颗粒生产层面的不同复杂性。生成高质量、GMP级mRNA通常涉及从线性化质粒DNA模板进行体外转录，然后是纯化以去除双链RNA污染物，掺入修饰核苷，以及严格的质量控制以确认序列身份、帽完整性、poly(A)尾长度以及不存在残留DNA。临床规模LNP制造需要精确、可扩展的混合技术如微流体系统，严格控制粒径和多分散性，优化包封效率，以及在整个产品生命周期中对稳定性和效力进行全面表征。

肿瘤微环境障碍：免疫抑制性肿瘤微环境（TME）仍然是体内生成的CAR-T细胞的主要障碍，这与体外产品面临的挑战相似。来自全身LNP递送的CAR-T细胞必须在以PD-1/PD-L1检查点参与、TGF-β驱动的耗竭、以及与肿瘤和基质细胞的激烈代谢竞争为特征的环境中发挥作用。这些因素共同限制了CAR-T细胞在实体瘤中的浸润、存活和细胞毒性。因此，联合策略正在成为体内mRNA-CAR-T平台的一个关键焦点。

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结语

体内 mRNA-CAR-T 细胞疗法正处于科学概念与临床现实之间的真正转折点。在这种新兴模式中，脂质纳米颗粒工程、精准免疫细胞靶向、合成生物学和 mRNA 治疗学的进展正在汇聚，将患者自己的身体转变为 CAR-T 制造生物反应器，消除了白细胞分离术、体外处理和整合病毒载体的需求。

这种真正现货型、可快速制造且固有自限性的细胞疗法，可作为一剂RNA-LNP小瓶递送，几乎可以施用于任何符合条件的患者，无论年龄、前期治疗强度或物流可及性如何。这样的转变不仅将拓宽基于CAR的干预措施在肿瘤学、自身免疫以及纤维化或感染性疾病中的覆盖范围，而且将从根本上改变个性化免疫治疗的经济学和可扩展性。随着第一批体内mRNA-CAR-T试验的成熟，使用非病毒核酸技术直接在患者体内编程免疫细胞的更广泛的体内合成免疫学范式，似乎有望成为未来十年免疫肿瘤学和免疫调节疗法中的决定性力量。

参考资料：

In Vivo mRNA-Lipid Nanoparticle CAR-T Cell Engineering: Advances, Challenges, and Clinical Translation. Biomedicines. 2026 Jun 3;14(6):1276.