Cell Metab (1区，IF=37.0)｜肠菌来源Kpaa“改造”线粒体：SIRT3缓解HSP60苯乙酰化损伤，关联MASH进展！(谭敏佳/叶邦策...

2026年6月24日，华东理工大学叶邦策团队、中国科学院上海药物研究所谭敏佳/许骏宇/李静雅团队等，联合上海交通大学医学院附属瑞金医院、复旦大学、同济大学等单位，在Cell Metabolism（中科院1区，IF=37.0）在线发表题为“Gut microbiota-derived lysine phenylacetylation impairs mitochondrial function and is alleviated by SIRT3”的研究论文。该文于2024年12月29日投稿，2026年1月27日修回，2026年5月29日接收，发表于 Cell Metabolism 38卷。

该研究发现了一种由膳食苯丙氨酸经肠道菌群代谢产生的新型赖氨酸翻译后修饰——赖氨酸苯乙酰化（Kpaa）。研究显示，肠菌来源苯乙酸（PAA）可在宿主肝脏中转化为苯乙酰辅酶A（PAA-CoA），进而诱导蛋白Kpaa修饰；Kpaa主要富集在线粒体相关蛋白上，并可损伤线粒体功能、干扰胰岛素信号。机制上，PAA诱导HSP60发生K481位点苯乙酰化，削弱HSP60/HSP10复合体功能，触发线粒体未折叠蛋白反应（mtUPR）应激；而SIRT3具有去苯乙酰化作用，能够缓解这一过程。人肝组织样本进一步显示，肥胖合并代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）患者肝脏中Kpaa水平升高、SIRT3表达降低，二者与疾病活动度相关。该研究为理解“膳食—肠菌代谢物—宿主翻译后修饰—线粒体功能障碍—MASLD/MASH进展”提供了新的机制线索。

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【摘 要】

肠道菌群（gut microbiota，GM）紊乱参与多种常见代谢性疾病的发生发展。短链脂肪酸不仅可作为信号分子，还可作为宿主蛋白翻译后修饰的供体。本研究报道了一种新的赖氨酸修饰类型——赖氨酸苯乙酰化（lysine phenylacetylation，Kpaa），其来源于肠道菌群中依赖苯丙氨酸的苯乙酸（phenylacetic acid，PAA）代谢通路。

在高脂饮食诱导肥胖的小鼠中，肝脏Kpaa水平显著升高，而去酰化酶sirtuin 3（SIRT3）可降低这一修饰水平。蛋白质组范围内的底物分析显示，Kpaa修饰底物显著关联于线粒体。PAA可破坏线粒体功能，并损害胰岛素信号。机制上，PAA诱导HSP60发生K481位点苯乙酰化，触发线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response，mtUPR），而这一过程可被SIRT3逆转。

最后，在肥胖并伴有代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis，MASH）的成人肝脏样本中，较低的肝脏SIRT3水平与升高的Kpaa水平呈负相关。总体而言，本研究揭示了一种来源于肠道菌群的赖氨酸酰化修饰，并阐明其在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease，MASLD）/MASH发展中的生物学意义。

01

研究背景及科学问题

肠道菌群（GM）是一个复杂且空间异质性明显的系统，由细菌、真菌、病毒等多种微生物组成。这些微生物不仅彼此相互作用，也与宿主发生密切联系。越来越多研究表明，肠道菌群参与肥胖和2型糖尿病的发生，而这些疾病又与代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）密切相关。小鼠研究和粪菌移植实验提示，肠道菌群可能在MASLD进展中具有潜在因果作用。随后的人群研究也开始描绘MASLD中的肠道菌群改变，并发现一些较为一致的微生物组特征，可区分健康人群、MASLD患者，以及进展至代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的患者。MASH进一步进展可导致肝硬化和/或肝细胞癌。然而，肠道菌群与MASLD/MASH之间相互作用的生理和病理机制仍未被充分阐明。

肠道微生物组可被视为一个庞大的遗传信息库，其携带的遗传信息量超过人类基因组。肠道微生物代谢物是宿主—菌群互作的重要介质，可进入宿主组织并参与维持生理功能。当这些代谢物浓度发生异常改变时，也可能参与代谢性疾病的发生。宿主细胞内代谢物通常与特定代谢通路相联系，其新的生物学功能正在不断被揭示。近期研究显示，多种短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），如乙酸、丁酸和丙二酸，可作为蛋白翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）的供体。这些修饰既可通过酶促方式发生，也可通过非酶促方式形成，提示PTMs可能通过影响代谢网络发挥调控作用。

这一机制并不局限于宿主来源的细胞内代谢物。微生物代谢物及其衍生物同样可作为PTM反应供体。例如，肠道菌群来源的3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HPA）可诱导宿主整合素αIIb蛋白发生半胱氨酸羧乙基化，形成新抗原并刺激CD4+介导的自身免疫反应。因此，探索来源于肠道菌群的SCFAs及其与相应PTMs之间的联系，有助于理解生理和病理状态下宿主—肠道菌群互作机制。

苯乙酸（phenylacetic acid，PAA，也称phenylacetylate）是肠道菌群利用膳食苯丙氨酸产生的微生物代谢产物。既往针对肥胖非糖尿病女性肝脂肪变性患者的分子表型组学和宏基因组学研究提示，PAA可促进肝脏脂质积累并触发脂肪变性。PAA还可进一步被宿主肝脏酶催化生成苯乙酰谷氨酰胺（phenylacetyl-glutamine，PAGln），后者可通过α2A、α2B和β2肾上腺素能受体介导细胞事件，促进与心血管疾病相关的表型。尽管这些研究提示肠菌来源PAA在代谢和心血管疾病中具有重要作用，但PAA是否还能通过诱导蛋白翻译后修饰等额外机制发挥调控作用，仍不清楚。

在本研究中，作者鉴定出一种由肠道菌群来源苯乙酸诱导的新型赖氨酸修饰，并将其命名为赖氨酸苯乙酰化（Kpaa）。对Kpaa调控酶的研究显示，酰基辅酶A合成酶家族成员2（acyl-CoA synthetase family member 2，ACSF2）可作为苯乙酰辅酶A合成酶，将PAA转化为苯乙酰辅酶A（PAA-CoA），进而参与Kpaa形成；而SIRT3表现出蛋白去苯乙酰化活性。全局底物分析显示，Kpaa与线粒体功能密切相关。高水平Kpaa修饰可破坏线粒体功能，并与MASLD进展相关。

02

重要发现及亮点

肠菌宏蛋白组提示高脂饮食小鼠苯乙酸异常积累

为探究肠道菌群与MASLD之间的生理病理机制，研究者首先在高脂饮食（high-fat diet，HFD）诱导肥胖小鼠中开展肠道菌群多组学分析。研究采集HFD喂养小鼠和普通饲料（normal chow，NC）喂养小鼠的粪便样本进行宏基因组分析。HFD小鼠表现出更高的体重、肝脏甘油三酯（triglyceride，TG）水平以及肝切片脂滴积累。

与此同时，研究者使用纳升级液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行宏蛋白组分析。基于物种组成的主成分分析和基于KO丰度的宏蛋白组分析均能有效区分HFD组和NC组。粪便样本物种注释显示，大约80%的宏基因组基因可在门水平完成注释。在宏蛋白组定量到的112个物种中，31个物种发生显著变化，主要分布于厚壁菌门和拟杆菌门，提示HFD和NC小鼠的肠道菌群在组成和功能上均存在差异。其中，30个物种在宏基因组和宏蛋白组两个层面均发生显著改变，且变化方向相似。

进一步分析KEGG代谢通路中的差异表达蛋白后，研究者发现HFD小鼠微生物苯丙氨酸代谢通路中4种酶显著改变，包括amiE、paaK、tryB和dat。因此，作者推测苯丙氨酸代谢通路中的代谢物可能参与MASLD进展。宏蛋白组定量显示，PAA生物合成相关蛋白发生改变，提示PAA在肠道菌群中积累。随后，研究者通过LC-MS检测粪便PAA水平，发现HFD小鼠肠道PAA显著升高。由于PAA结构上类似苯甲酸，而苯甲酸可作为赖氨酸苯甲酰化（Kbz）的前体，研究者进一步假设：PAA可能在体内转化为高能供体PAA-CoA，从而驱动Kpaa反应。HPLC-MS/MS结果证实，小鼠肝脏中存在PAA-CoA，并且HFD小鼠肝脏中PAA-CoA显著升高。

图1：肠道菌群宏蛋白组学揭示HFD喂养小鼠中苯乙酸浓度异常。（A）实验流程示意图。（B）宏基因组和宏蛋白组中显著变化物种的倍数变化（n = 3）。（C）基于宏蛋白组的蛋白定量结果（n = 3）。（D）相关苯乙酸代谢通路示意图。（E）小鼠粪便样本中的苯乙酸水平（n = 3）。（F）PAA-CoA结构，以及从小鼠肝脏样本中体内生成的PAA-CoA代表性MS/MS谱图（n = 5）。数据以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，采用Student’s t检验（C、E和F）。

Kpaa被鉴定为一种新的蛋白翻译后修饰

Kpaa修饰发生在赖氨酸残基上，对应+118.0418 Da的质量增加，其化学式为C8H6O，代表苯乙酰基。为验证Kpaa是否在体内存在，研究者制备了泛抗苯乙酰赖氨酸抗体。该抗体能够识别含有苯乙酰化赖氨酸的肽库，而不能识别未修饰赖氨酸、乙酰赖氨酸或苯甲酰赖氨酸肽库，说明其对Kpaa肽具有较好特异性。

利用该泛抗体，研究者发现PAA可在小鼠原代肝细胞和SW480细胞中以浓度依赖方式增加Kpaa水平。小鼠接受PAA处理后，肝脏Kpaa信号增加，但赖氨酸乙酰化（Kac）、苯甲酰化（Kbz）、丙二酰化（Kmal）和琥珀酰化（Ksucc）等其他酰化修饰并未同步升高。竞争实验进一步显示，苯乙酰化赖氨酸肽库，而不是未修饰肽库，能够竞争掉全细胞裂解物中的多个Kpaa信号条带。

为进一步验证Kpaa修饰，研究者进行苯乙酰化肽亲和富集和MaxQuant分析，在假阳性发现率（false discovery rate，FDR）<1%、Andromeda评分≥50的条件下，共鉴定到543个蛋白上的1,927个Kpaa位点。研究者随后合成了与体内组蛋白H2B肽序列相同的候选苯乙酰化肽PEPAKpaaSAPAPK，并通过nano-HPLC-MS/MS比较体内肽段与合成肽段。结果显示，二者MS/MS谱图几乎一致；体内肽段与合成肽段混合后，在HPLC中形成单一共洗脱峰。这些结果共同证明，+118.0418 Da的质量偏移来源于一种新的翻译后修饰——Kpaa。

研究者还使用同位素标记方法追踪PAA是否可作为Kpaa来源。小鼠原代肝细胞经20 mM D5-苯乙酸或普通苯乙酸处理24 h后，蛋白经胰蛋白酶消化，并通过抗Kpaa免疫沉淀富集轻/重标记Kpaa肽段用于HPLC-MS分析。结果鉴定出1,472个重标记Kpaa位点，其中62%同时检测到轻标记苯乙酰化。典型肽段DPGNEVKpaaLR和SSISVQQEKpaaETIAK的MS/MS谱图显示，D5标记Kpaa位点出现额外+5.0314 Da质量偏移。这进一步证明Kpaa在体内存在，并确认PAA可作为Kpaa前体代谢物。

此外，研究者在Kpaa修饰肽段的MS/MS低质量区观察到m/z 219.1492的线性亚胺离子（LinIm），以及更强的m/z 202.1232环状亚胺离子（CycIm），后者可能由LinIm离子失去NH3形成。这些特征离子为Kpaa特异性质谱裂解模式提供了有力证据，提高了Kpaa鉴定置信度。

图2：Kpaa的鉴定。（A）赖氨酸苯乙酰化（Kpaa）的结构。（B）泛抗Kpaa抗体的特异性。（C）PAA刺激诱导Kpaa。PAA处理24 h后，对PAA处理的小鼠原代肝细胞全细胞裂解物进行western blot分析。（D和E）小鼠原代肝细胞（D）和SW480细胞（E）全细胞裂解物的竞争分析。（F）体内PEPAKpaaSAPAPK肽段和合成肽段的标注MS/MS谱图。（G）HPLC/MS/MS分析中体内来源肽段、对应合成Kpaa肽段及二者混合物的重构离子色谱图。（H）体内富集的DPGNEVKpaa（+118.0418）LR肽段和DPGNEVK D5-paa（+123.0732）LR肽段的MS/MS谱图。

Kpaa动态变化反映肠菌—宿主代谢轴

为了观察Kpaa在体内不同组织中的分布，研究者使用抗Kpaa抗体进行western blot分析。结果显示，小鼠多种组织中均可检测到蛋白Kpaa信号。其中，PAA灌胃小鼠的肝脏Kpaa水平明显高于其他组织。PAA定量分析显示，口服PAA可显著增加小鼠门静脉PAA水平，提示PAA可被肠道有效吸收并输送至肝脏。

随后，western blot结果显示，与NC小鼠相比，HFD小鼠在喂养1、4、8和16周后肝脏Kpaa水平均显著升高。与PAA灌胃实验一致，肝脏Kpaa水平明显高于其他组织。这提示HFD小鼠肠道菌群中PAA水平升高，可能促进肝脏PAA浓度增加。值得注意的是，PAA或其前体苯丙氨酸给药均可在小鼠肝脏中以剂量和时间依赖方式显著增加细胞Kpaa水平。

由于肠道菌群是宿主体内PAA产生的重要来源，研究者进一步考察细胞蛋白Kpaa水平是否与肠菌来源PAA相关。抗生素混合物处理小鼠后，粪便和血清中微生物来源PAA明显下降，同时肝脏和结肠组织Kpaa水平降低。研究者还构建了能够在肠道中通过PAA生物合成酶PPDC和PPFOR产生PAA的工程化大肠杆菌Nissle 1917菌株（EcNPPDC + PPFOR）。与野生型EcNWT定植相比，EcNPPDC + PPFOR定植小鼠血清PAA显著升高，尽管粪便PAA变化不显著；western blot显示，工程菌定植还提高了肝脏和结肠蛋白Kpaa水平。

进一步聚焦与肠道PAA代谢密切相关的梭菌属后，研究者发现Clostridium asparagiforme在HFD小鼠中显著增加。由于C. asparagiforme可在体外将苯丙氨酸转化为PAA，作者选择该菌进行进一步验证。无菌（germ-free，GF）小鼠肝脏和结肠Kpaa水平显著低于特定病原体阴性（specific pathogen-free，SPF）小鼠；但C. asparagiforme定植GF小鼠后，这些组织中的Kpaa水平恢复。血清和粪便PAA也呈相似变化趋势。因此，HFD小鼠中PAA产生菌，如C. asparagiforme，丰度升高，被认为是Kpaa水平升高的重要因素。

研究者还发现，在大肠杆菌、酿酒酵母和秀丽隐杆线虫全蛋白组裂解物中也能检测到Kpaa信号，提示Kpaa在不同物种中可能具有一定进化保守性。

图3：Kpaa水平的动态变化反映NC/HFD喂养小鼠中的肠菌—宿主代谢轴。（A）小鼠外周器官提取物中Kpaa存在情况的代表性分析。C57BL/6J小鼠口服给予载体（Veh）或PAA，连续3天。（B）HFD喂养小鼠和对照小鼠喂养1、4、8和16周后，肝脏全局Kpaa水平的代表性western blot分析（n = 4）。（C和D）抗生素（Abx）混合物对体内PAA产生（C）以及全局蛋白Kpaa对肠道菌群改变敏感性（D）的影响。6周龄雄性C57BL/6J小鼠口服给予Veh和Abx，连续14天（n = 5）。（E和F）PAA产生菌定植对PAA水平（E）以及肝脏和结肠Kpaa水平（F）的影响。6周龄雄性C57BL/6J小鼠口服给予EcNWT和EcNPPDC + PPFOR，连续14天（n = 5）。（G和H）C. asp定植对PAA水平（G）以及肝脏和结肠Kpaa水平（H）的影响。8周龄雄性SPF和GF C57BL/6J小鼠口服给予PBS和C. asp，连续14天（n = 3–4）。C. asp为C. asparagiforme。数据以均值 ± SEM表示。**p < 0.01，***p < 0.001，采用Student’s t检验（C和E）或单因素方差分析（G）。

SIRT3去除Kpaa，ACSF2则作为PAA-CoA合成酶

基于Kpaa与Kbz在结构上的相似性，研究者推测Kpaa可能由sirtuin家族酶去除。为验证这一点，研究者以合成肽PEPAKpaaSAPAPK为底物，筛选sirtuin 1–7。HPLC-MS/MS分析显示，SIRT1、SIRT2和SIRT3在体外具有去苯乙酰化活性，而SIRT4–SIRT7未显示明显去苯乙酰化活性。

为了进一步确认SIRT1–SIRT3在细胞中的去苯乙酰化活性，研究者在肝细胞中瞬时转染并过表达SIRT1、SIRT2和SIRT3。结果发现，SIRT3过表达可降低肝细胞全局Kpaa水平，而SIRT1/2未见明显影响。随后，在野生型（WT）和Sirt3−/−（KO）小鼠中验证SIRT3体内活性。结果显示，无论是否给予PAA，Sirt3−/−小鼠肝脏全局Kpaa水平均高于WT小鼠。进一步检测其他SIRT3调控的PTMs后发现，与PAA处理的WT对照相比，SIRT3-KO仅增加Kpaa和Kac水平，并未增加Kbz、Kmal或Ksucc等其他修饰。HFD小鼠中Kpaa水平升高的同时，SIRT3蛋白表达下降，提示SIRT3降低可能是HFD小鼠Kpaa积累的原因之一。

另一方面，研究者发现，与PAA相比，蛋白Kpaa对PAA-CoA更加敏感，在小鼠原代肝细胞裂解物中较低浓度PAA-CoA即可诱导反应。这提示PAA需要在细胞内转化为高能中间体PAA-CoA，才能促进Kpaa形成。通过与细菌苯乙酰辅酶A合成酶PaaK进行同源性比对，研究者发现人源ACSF2可能具有苯乙酰辅酶A合成酶活性。体外孵育和HPLC-MS/MS结果证实，ACSF2可由PAA和CoA生成PAA-CoA。细胞验证进一步显示，HEK293T细胞过表达ACSF2后，在PAA处理条件下Kpaa水平显著升高；相反，在小鼠原代肝细胞中敲低ACSF2可明显降低Kpaa水平。组织特异性表达分析显示，ACSF2主要在肝脏高表达，这与肝脏Kpaa水平较高相吻合，也解释了肝脏中PAA可高效转化为活性PAA-CoA的机制。

图4：调控赖氨酸Kpaa水平的酶筛选。（A）根据色谱峰曲线下面积（area under the curve，AUC）计算的SIRT1–SIRT7去苯乙酰化活性百分比；另见图S4A。（B）SIRT1、SIRT2和SIRT3可催化合成Kpaa肽段的体外去苯乙酰化反应。（C）分别转染FLAG-vector、Sirt1-FLAG、Sirt2-FLAG和Sirt3-FLAG质粒的小鼠原代肝细胞，在有或无PAA处理后，全局Kpaa水平的western blot分析；另见图S4B。（D）Veh灌胃、SIRT3-KO和WT小鼠肝脏中全局Kpaa水平和SIRT3表达的western blot分析。（E）HFD喂养小鼠肝脏中SIRT3表达水平的western blot分析，以NC喂养组作为对照。（F）通过与底物PAA和CoA孵育检测ACSF2合成PAA-CoA的能力。MS/MS谱图显示合成PAA-CoA（上）和体外生成PAA-CoA（下）的特征碎片离子。柱状图定量显示，与PBS对照相比，ACSF2产生的PAA-CoA相对水平（n = 3）。（G）ACSF2敲低后，小鼠原代肝细胞中Kpaa水平。数据以均值 ± SEM表示。**p < 0.01，采用Student’s t检验（F）。

Kpaa底物富集于线粒体，并损害线粒体功能

为系统表征Kpaa底物，研究者从PAA给药后的小鼠肝脏中富集Kpaa肽段，并用HPLC-MS/MS进行分析。结果共鉴定到519个Andromeda评分≥50的Kpaa位点，分布在236个苯乙酰化蛋白底物上。其中约42.8%的蛋白具有两个或更多苯乙酰化位点。

进一步比较Kpaa与其他赖氨酸酰化修饰位点，包括Kac、Ksucc和Kmal后，研究者分析了Kpaa位点周围氨基酸偏好。结果显示，在修饰赖氨酸前一位（−1）显著富集赖氨酸或精氨酸，而后一位（+1）富集甘氨酸、组氨酸或异亮氨酸。Kpaa位点最多的蛋白是氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1），共含30个Kpaa位点。KEGG通路分析显示，Kpaa显著富集于多种细胞代谢过程，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、脂肪酸降解以及丙酸代谢等。GO细胞组分分析显示，Kpaa蛋白高度富集在线粒体中，超过本研究鉴定到的赖氨酸苯乙酰化蛋白的四分之三。STRING蛋白互作网络进一步显示，Kpaa富集于氧化磷酸化、脂肪酸降解、谷胱甘肽代谢、支链氨基酸降解、核糖体以及谷氨酰胺/谷氨酸代谢等相关模块。

为了评估Kpaa对线粒体功能的影响，研究者使用Seahorse XFe96检测细胞呼吸。结果显示，PAA以浓度依赖方式降低氧耗率（oxygen consumption rate，OCR）。通过TMRE和JC-1染色检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）后发现，PAA处理以及PAA与棕榈酸（PA）共处理均显著降低MMP，提示线粒体呼吸能力下降。DCFH-DA探针检测显示，PAA以剂量依赖方式增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可抑制PAA诱导的ROS升高，说明DCF信号对PAA刺激具有特异响应。

此外，随着Kpaa水平升高，PAA处理24 h的小鼠原代肝细胞中AKT Ser473磷酸化明显降低，提示PAA损害胰岛素信号。C12-BODIPY染色结果进一步显示，在人源THLE2和小鼠AML12肝细胞系中，PAA处理24 h可剂量依赖性增加脂滴积累，提示PAA对肝细胞具有直接促脂肪变性作用。

图5：从位点、蛋白和通路水平表征Kpaa底物。（A）从健康小鼠经胃内给药（i.g.）PAA后的肝组织中获得Kpaa肽段，并进行亲和富集；另见表S2A。（B）具有多个Kpaa位点的蛋白分布。（C）用于探索Kpaa生物学功能的KEGG通路分析；另见表S2C。（D）受Kpaa调控的蛋白—蛋白互作网络。（E）Seahorse XFe96分析小鼠原代肝细胞经不同浓度PAA处理24 h后的细胞呼吸（n = 4）。（F）TMRE分析小鼠原代肝细胞经不同浓度PAA处理，并与PA或BSA Veh共处理24 h后的MMP（n = 5–6）。（G）流式细胞术图谱显示细胞经PAA（1、5、10和20 mM）刺激24 h后细胞内ROS生成情况。未处理组作为对照。DCFH-DA用作细胞内ROS探针（n = 9）。数据以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，采用单因素方差分析（E–G）。

HSP60的K481苯乙酰化损害mtUPR和线粒体功能

在线粒体苯乙酰化蛋白中，60 kDa热休克蛋白（HSP60）位列前五。研究者通过抗HSP60或抗Kpaa共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，coIP）实验确认，PAA处理后HSP60确实发生Kpaa修饰。另一种线粒体蛋白HSPA9也通过抗HSPA9 coIP得到验证。重要的是，从肝脏裂解物中免疫沉淀HSP60并进行western blot分析后发现，在PAA处理肝脏中，HSP60主要富集Kpaa，而不是其他4种酰化修饰；并且SIRT3-KO小鼠中HSP60的Kpaa进一步增加。

HSP60是由HSPD1编码的重要分子伴侣蛋白，主要定位于线粒体，并在线粒体未折叠蛋白反应（mtUPR）通路中发挥关键作用。HSP60对于维持线粒体呼吸链完整性、线粒体功能和细胞存活至关重要。为确认Kpaa对HSP60功能的影响，研究者检测了HSP60与共伴侣蛋白HSP10之间的相互作用，因为HSP10是HSP60介导蛋白正确折叠所必需的。coIP结果显示，PAA处理显著破坏HSP60-HSP10相互作用。

随后，研究者使用TPE-MI染料检测线粒体内未折叠蛋白负荷。TPE-MI荧光仅在标记游离半胱氨酸硫醇后被激活，而这些硫醇通常埋藏于球状蛋白核心，在蛋白展开时暴露。结果显示，PAA处理后，无论是否与PA共处理，TPE-MI与MitoTracker共定位均增加，提示HSP60介导的mtUPR受损。SIRT3过表达细胞则能够抵抗PAA诱导的mtUPR损伤。研究者还检测了激活转录因子5（ATF5）定位变化。正常情况下，ATF5定位于线粒体；在线粒体损伤应激下，ATF5转位至细胞核，启动mtUPR相关蛋白表达。结果显示，BSA/PAA或PA/PAA处理肝细胞后ATF5核定位增加，而SIRT3过表达可恢复这一变化。

为确定HSP60中负责功能损伤的关键Kpaa位点，研究者使用PAA-NHS对重组HSP60进行化学苯乙酰化，并分析SIRT3介导的位点特异性去苯乙酰化。实验在HSP60上鉴定到40个Kpaa位点，其中31个位点也出现在小鼠原代肝细胞和肝组织亲和富集样本中。经SIRT3处理后，13个Kpaa位点显著下降超过50%；其中ISKpaaGANPVEIR肽段对应的K481位点苯乙酰化水平下降约82%。

进一步使用HSP60野生型和候选位点赖氨酸突变为丙氨酸的过表达质粒后，研究者发现10 mM PAA处理24 h显著增强HSP60-WT的Kpaa修饰，而K58A、K133A、K359A和K481A突变显著减弱Kpaa水平，提示这些赖氨酸残基可能是HSP60苯乙酰化的主要靶点。功能实验显示，PAA显著破坏HSP60-HSP10相互作用，而K133A、K359A和K481A突变可在较大程度上恢复这一相互作用。敲低HSP60后再回补WT或Kpaa抵抗突变体，TMRE和Seahorse实验进一步证实，PAA对线粒体功能的影响直接依赖K481位点修饰。

最后，研究者设计并合成了5种线粒体靶向细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs），用于竞争性抑制HSP60特定位点Kpaa。免疫荧光证实这些CPP融合肽可与HEK293细胞线粒体共定位。coIP显示，对应K58、K133、K359和K481的CPP融合肽可显著降低HSP60上的Kpaa修饰水平。在功能上，靶向K481修饰的肽可有效挽救PAA诱导的线粒体呼吸损伤和MMP下降。总体而言，阻断HSP60 K481位点Kpaa足以恢复HSP60/HSP10复合体组装并保护线粒体功能，从而建立了HSP60-Kpaa修饰与线粒体功能损害之间的因果联系。

图6：HSP60的Kpaa修饰损害mtUPR和线粒体功能。（A–C）在PAA处理的小鼠原代肝细胞中，对HSP60及其Kpaa修饰进行共免疫沉淀（coIP）和western blot分析。（A）使用HSP60抗体进行coIP。（B）使用Kpaa抗体进行coIP。（C）FLAG-HSP60与血凝素（hemagglutinin，HA）-HSP10的coIP。（D和E）在HepG2细胞中，经指定处理后，使用TPE-MI和MitoTracker染色（D）并进行定量分析（E），评估线粒体内细胞未折叠蛋白负荷。比例尺，10 μm。（F和G）在PAA处理的小鼠原代肝细胞（F）和转染ATF5质粒的肝细胞（G）中，对ATF5进行核质分离分析。（H和I）在转染HSP60-WT及其突变体的小鼠原代肝细胞中，经PAA处理后，对HSP60及其Kpaa修饰（H）以及FLAG-HSP60和HA-HSP10（I）进行coIP和western blot分析。（J）在HSP60敲低的小鼠原代肝细胞中，转染HSP60-WT及其突变体，在有或无PAA处理条件下，通过TMRE染色分析MMP（n = 6）。（K）在PAA处理的小鼠原代肝细胞中，并与HSP60 Kpaa修饰阻断肽共处理后，对FLAG-HSP60及其Kpaa修饰进行coIP和western blot分析。（L）在PAA处理的小鼠原代肝细胞中，与HSP60 Kpaa阻断肽K481共处理后，使用Seahorse XFe96分析细胞呼吸（n = 3）。（M）在PAA处理的小鼠原代肝细胞中，与HSP60 Kpaa阻断肽K359或K481共处理后，通过TMRE染色分析MMP（n = 4–5）。数据以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001，采用单因素方差分析（J、L和M）。

Kpaa升高与SIRT3下调及MASLD/MASH病理进展相关

线粒体是肝脏正常生理和细胞功能的核心。越来越多证据提示，针对线粒体功能障碍的干预可能是MASH治疗的重要方向。为研究Kpaa在MASLD/MASH进展中的作用，研究者使用酪胺信号放大（tyramide signal amplification，TSA）多重免疫组织化学（multiplex immunohistochemistry，mIHC）检测肥胖成人肝组织样本中Kpaa水平和SIRT3表达，这些样本来自伴MASH（n = 15）或不伴MASH（n = 15）的肥胖个体。

mIHC结果显示，与无MASH肥胖个体相比，MASH患者肝脏Kpaa水平更高、SIRT3蛋白水平更低。肝脏Kpaa水平与非酒精性脂肪性肝病活动度评分（NAFLD activity score，NAS）呈正相关；肝脏SIRT3表达与NAS评分及Kpaa水平均呈负相关。随后，研究者检测正常个体（n = 8）以及上述肥胖伴或不伴MASH个体粪便样本中的PAA浓度。靶向代谢组学显示，与正常个体相比，肥胖个体粪便PAA浓度更高，尤其是MASH个体。然而，肝脏Kpaa水平与粪便PAA浓度无显著相关性，而是与肝脏SIRT3表达呈负相关。这提示观察到的肝脏Kpaa升高可能主要归因于SIRT3降低，强调了SIRT3在肝内调控中的关键作用。

为进一步研究SIRT3在MASLD进展中调控Kpaa的作用，研究者让HFD喂养16周的小鼠经尾静脉注射shSIRT3-AAV，实现肝脏特异性SIRT3敲低，并继续观察16周（n = 10）。尽管体重和器官重量未发生明显变化，SIRT3敲低仍促进了更严重的病理状态，表现为血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）显著升高，提示肝损伤加重；H&E和油红O染色显示脂质积累更严重；肝脏TG和总胆固醇（total cholesterol，TC）水平升高，证实脂质代谢功能障碍。HFD喂养和SIRT3敲低均可上调肝脏Kpaa水平。

此外，为评估长期PAA暴露效应，研究者使用含0.8% PAA的定制饲料干预C57BL/6J小鼠。结果显示，PAA饮食增加小鼠体重，但不改变肝重/体重比；血清ALT和AST升高；肝脏TG含量增加，但TC未受影响。肝切片组织学检查显示，与普通饲料对照相比，PAA喂养小鼠肝脏脂滴积累更明显。总体来看，肥胖合并MASH患者肝脏样本中存在更高Kpaa修饰水平和更低SIRT3表达水平，二者均与NAS评分和疾病进展相关。

图7：高水平Kpaa修饰和SIRT3下调伴随MASH病理进展。（A–C）通过TSA检测，在伴MASH（n = 15）或不伴MASH（n = 15）的肥胖个体肝切片中进行Kpaa和SIRT3多重免疫组织化学（mIHC）染色。比例尺，20 μm。肝脏Kpaa水平（B）和SIRT3水平（C）的定量分析。（D和E）在伴MASH（n = 15）或不伴MASH（n = 15）的肥胖个体肝切片中，分析肝脏Kpaa水平（D）和SIRT3水平（E）与NAS评分的相关性。（F）在伴MASH（n = 15）或不伴MASH（n = 15）的肥胖个体肝切片中，分析肝脏Kpaa水平与SIRT3水平的相关性。（G和H）NC饮食或HFD喂养的AAV-shScramble和AAV-shSirt3小鼠血清ALT和AST水平（n = 10）。（I）NC喂养或HFD喂养的AAV-shScramble和AAV-shSirt3小鼠肝切片H&E染色和油红O染色。（J和K）指定小鼠组肝脏中甘油三酯（TG，J）和总胆固醇（TC，K）水平（n = 10）。（L）指定小鼠组肝脏中SIRT3表达和Kpaa水平的代表性western blot分析。数据以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，采用Student’s t检验（B和C）或单因素方差分析（G、H、J和K）。

【贡献】★★★★★

本研究揭示了一种新的蛋白翻译后修饰——赖氨酸苯乙酰化（Kpaa）。Kpaa来源于肠道菌群产生的PAA，而PAA可由膳食苯丙氨酸经肠道菌群代谢生成。研究显示，PAA在肝脏中可经ACSF2转化为PAA-CoA，从而促进宿主蛋白发生Kpaa修饰；SIRT3则具有去苯乙酰化活性，可降低Kpaa水平。

功能上，Kpaa高度关联线粒体通路。PAA诱导HSP60发生Kpaa修饰，尤其是K481位点苯乙酰化，削弱HSP60/HSP10复合体组装，扰乱HSP60介导的线粒体未折叠蛋白反应，并损害线粒体呼吸、线粒体膜电位和细胞氧化还原稳态。SIRT3可缓解这一过程。

在人肝组织样本和小鼠模型中，MASH相关病理状态伴随Kpaa升高和SIRT3降低。作者认为，肠道菌群来源代谢物通过调控宿主蛋白翻译后修饰影响线粒体稳态，可能是MASLD/MASH发生发展的重要机制之一。与此同时，研究也指出，临床样本量仍相对有限，肠道菌群在临床情境中是否发挥相同作用仍需更大规模研究验证；除HSP60之外，PAA是否还作用于其他直接底物或调控其他功能，也有待进一步探索。

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